Ідентифікація сайтів геномного зв’язування фактору транскрипції в гостроочищеному PDGFR; Клітини від
Резюме
Тут ми представляємо протокол, призначений для аналізу загальногеномного зв’язування фактора транскрипції олігодендроцит 2 (Olig2) у гостро очищених клітинах-попередниках олігодендроцитів мозку (OPC) шляхом проведення імунопреципітації низькоклітинного хроматину (ChIP), підготовки бібліотеки, високопродуктивного секвенування та біоінформаційний аналіз даних.
Анотація
Вступ
Важливо вивчити зв'язування білка (або білкового комплексу) з ДНК та епігенетичні маркери для побудови транскрипційних регуляторних мереж у різних біологічних процесах. Зокрема, зв’язок між факторами транскрипції та геномною ДНК може відігравати важливу роль у регуляції генів, диференціації клітин та розвитку тканин. Це потужний інструмент для вивчення транскрипційної регуляції та епігенетичних механізмів імунопреципітації хроматину (ChIP). Завдяки швидкому прогресу в технології секвенування наступного покоління, аналіз зв'язування білка з ДНК та епігенетичні маркування використовується в 1 ChIP в парі з високопродуктивним секвенуванням ДНК (ChIP-Seq). Однак стандартний протокол ChIP-Seq вимагає приблизно 20 мільйонів клітин на реакцію, що ускладнює використання цієї методики, коли клітина обмежена, наприклад, ізольовані первинні клітини та рідкісні популяції клітин.
Клітини лінії олігодендроцитів, включаючи клітини-попередники олігодендроцитів (OPC) та олігодендроцити, широко розповсюджені по всьому мозку і мають важливе значення для розвитку та функціонування мозку. Як тип клітини-попередника, OPC можуть самостійно відновлюватися та диференціюватися. OPC не тільки служать попередниками олігодендроцитів, але також відіграють важливу роль у розповсюдженні нейронної сигналізації через зв'язок з іншими типами клітин мозку 2. Попередні дослідження припускали, що гендерні фактори транскрипції, такі як Olig2 та Sox10 3, 4, регулюють розвиток олігодендроцитів. Ці фактори транскрипції були розташовані в областях організатора або енхансера, щоб зв’язати деякі найважливіші гени з їх експресією, впливаючи на специфікацію та диференціацію олігодендроцитів. Однак важко виявити ДНК-зв’язуючий білок (або білковий комплекс), що цікавить гостро очищені первинні OPC з дуже обмеженою кількістю клітин.
Цей протокол описує, як систематично досліджувати геномну ДНК, імунопреципітовану Olig2 в очищених OPC мишей на загальногеномному рівні, використовуючи техніку ChIP-Seq. OPC мозку миші гостро очищали за допомогою імунопанпінгу та в експерименті з ЧІП без розповсюдження in vitro. Обмежена кількість OPC може бути отримана за допомогою імунопаннінгу та достатня для стандартних експериментів ChIP-Seq. Це описує низькоклітинний протокол ChIP-Seq з 20 тисячами клітин на реакцію ChIP для факторів транскрипції. Коротше кажучи, зшиті клітини лізували та обробляли ультразвуком за допомогою ультразвукового апарату, який стригав хроматин. Зрізаний хроматин інкубували з антитілами до Olig2 та сферами, покритими білком А, для осадження геномної ДНК, пов'язаної з антитілами Olig2. Після элюирования бісеру, покритого білком А, та зворотного зшивання, геномну ДНК осаджували антитілами Olig2 та очищали фенол-хлороформовою екстракцією. Отриманий продукт кількісно оцінили і піддали Т-хвосту, переключенню та розширенню шаблону світіння, доданню адаптерів та підсилення, вибору розміру бібліотеки та етапам очищення для побудови бібліотеки ChIP-Seq.
Після секвенування аналізували якість необроблених зразків, отриманих з використанням антитіл до транскрипційного фактора Olig2 та контрольної проби. Неповноцінні пари основ і адаптери з читанням, що фрагменти обрізані. Далі обрізані зчитування вирівнювались по еталонному геному миші. Геномні області, які були значно збагачені для зчитування ChIP, були визнані піками порівняно з контрольною зразком. Значні піки, що представляють можливі сайти зв'язування фактора транскрипції, відфільтровувались та візуалізувались у браузері геномів.
Метод, описаний у цьому протоколі, в основному може бути використаний для ChIP-Seq з інших факторів транскрипції з будь-яким типом клітин обмеженої кількості.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
Усі протоколи споживання тварин та експерименти проводились відповідно до Керівництва з догляду та використання лабораторних тварин та затверджено Інституційним комітетом з біобезпеки та Комітетом із захисту тварин при Науковому центрі охорони здоров’я Університету Техасу в Х'юстоні.
1. Очищення PDGFRα-позитивних клітин лінії олігодендроцитів від мозку миші (модифіковано з протоколів імунопаннінгу 5, 6, 7, описаних вище)
(2) Підготовка до низькоклітинних ChIP та побудова бібліотеки ChIP для високопродуктивного послідовності
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Після початкової оцінки контролю якості, необроблене зчитування та обрізка адаптерів та відставання нижчих пар основ є графіками контролю якості на Рисунку 4.показано. Обрізані зчитування повинні мати базову якість більше 30, не мати послідовностей адаптерів і мати низьке дублювання (Рисунок 4b-Д.). Хороша якість обрізаних зчитувань збільшує загальну швидкість вирівнювання. Інші параметри, такі як вміст ГХ, також важливі і їх слід враховувати для обрізки.
При використанні парних даних ChIP-Seq фрагменти зв'язуються навколо фактора транскрипції з певною відстанню поділу. Парне кінцеве секвенування дозволяє більш точно оцінити середню довжину фрагмента, даючи кращу оцінку геномних областей, де відбулося більше зв'язування. Діаграма кореляції ниток показує пікове значення збагачення, яке відповідає переважній довжині фрагмента. Як на малюнку 5знайдено, розрахована довжина фрагмента становить 130 bp, тоді як зчитування займає 50 bp. Набір даних ChIP-Seq, де довжина фрагмента довша за зчитування, свідчить про високу якість 16 .
У Silico додатковими методами до експерименту ChIP-Seq є аналіз збагачення мотивів та пошук мотивів de novo. Оскільки зв’язування Olig2 в OPC раніше не досліджувалося, для попередньої ідентифікації мотивів 4, 24 були використані клітини-попередники мотонейрону, отримані з Olig2 ChIP-Seq, та ембріональні стовбурові клітини. Ідентифіковані мотиви OLIG2 de Novo були додані до всебічної бази мотивів ENCODE 25 та проведено аналіз збагачення мотивів. Високе збагачення ідентифікованих de novo мотивів OLIG2 та відомого фактора транскрипції (HDAC2, SP1, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, SMAD2/3, PAX5 та ASCL1) були виявлені в піках ChIP-Seq клітин, очищених PDGFRα. Збагачення 30 de novo ідентифікує мотиви зі значенням E Рисунок 7 показує два найвищих ідентифікованих de novo мотиви Olig2. Ці два ідентифіковані de novo мотиви Olig2 були знайдені у> 60% очищених PDGFRα клітин, відновлених з піків ChIP-Seq, на додаток до відомих мотивів.
Обговорення
Після зшивання очищених OPC зшиті клітини слід промити крижаним розчином HBSS, а решту етапів ChIP виконувати при 4 ° C, інакше антитіло не може належним чином осадити геномну ДНК.
Наступним важливим кроком у цьому протоколі є підготовка бібліотеки. ПЛР-ампліфікація матеріалу ЧІП була використана для побудови бібліотеки. Кількість циклів ПЛР для підготовки бібліотеки залежить від кількості ДНК. Хороша бібліотечна підготовка вимагає точної кількісної оцінки кількості отриманої ДНК. Занадто багато або занадто мало циклів ПЛР може впливати на концентрацію бібліотеки, а також на складність, що призводить до артефактів ПЛР.
Складно побудувати бібліотеку ChIP-Seq, коли у вас обмежена кількість клітин для використання для імунопреципітації 27. Стандартний протокол ChIP, що використовується на сьогоднішній день, вимагає 10 нг препарату імунопреципітованої ДНК-ChIP-Seq 1, 28. Однак описаний тут протокол зазвичай генерує 2 нг імунопреципітованої ДНК антитілами Olig2 з 20000 OPC. ДНК використовується для підготовки бібліотеки ChIP-Seq за допомогою одноетапного адаптерного методу, що дозволяє покращити чутливість, що дозволяє посилити пікограми імунопреципітованої ДНК. Поєднуючи комерційні набори, цей протокол пропонує практичне рішення для проведення ChIP-Seq для факторів транскрипції на основі невеликої кількості клітин.
Важливо, що описаний протокол ChIP-Seq з низькими клітинами застосовується до ChIP-Seq з інших факторів транскрипції в первинних клітинах або рідкісних популяціях клітин. Антитіла, що використовуються в цьому протоколі, повинні бути перевірені експериментально, щоб спочатку провести конкретний експеримент ІС. Неспецифічне зв’язування антитіл призводить до поганих результатів. Крім того, рекомендується проводити цей низькоклітинний експеримент ChIP-Seq у клітинах з високою експресією фактора транскрипції, що цікавить.
Для аналізу даних може бути важко вирішити, які значення використовувати як відсікання після виклику пікової фільтрації. Залежно від мети аналізу можуть застосовуватися більш суворі або більш спокійні параметри. Як правило, використовується комбінація збагачення відсіку та значення p або FDR. Якщо раніше були відомі деякі ділянки зв'язування фактора транскрипції, це може допомогти у визначенні порогів фільтрації. Бази даних веб-сайтів, пов’язаних із фактором транскрипції, були зібрані з загальнодоступних експериментів ChIP-Seq в різних клітинних лініях та умовах 29, 30. Можна було б знайти ген і перевірити, чи не були заздалегідь знайдені сайти, що зв’язують фактор транскрипції. Однак важливо знати, що сайти зв’язування фактора транскрипції відрізняються залежно від типів клітин та умов.
У Silico додатковими методами до експерименту ChIP-Seq є аналіз збагачення мотивів та пошук мотивів de novo за допомогою програми MEME-ChIP 20 або подібних програм. Для пошуку мотивів потрібна всебічна відома база даних мотивів z, що походить від нового. B. ЗАКОДУЙ мотиви 25 або базу даних Hocomoco 31. Hocomoco - це база даних з мотивами, виявленими під час загальнодоступних експериментів ChIP-Seq на людині та миші. Якщо мотиви для передбачуваного білка невідомі, пошук мотивів de novo може виявити повторювані схеми послідовностей у значній частині піків як нових мотивів. Комбінаторні варіанти дії факторів транскрипції можуть бути представлені, якщо також знайдені мотиви з інших факторів транскрипції, збагачені отриманими піками.
Збагачені області піків можна перевірити експериментально, використовуючи хроматин мутованих або нокаутованих клітин як контрольних. Проведення ChIP-Seq з клітинами, які не експресують фактор транскрипції, використовується для ідентифікації хибнопозитивних піків, які також називаються "фантомними піками" 32. Помилкові позитивні результати відфільтровуються.
Також цікаво порівняти отримані піки ChIP-Seq з транскриптомними даними. Піки PDGFRα-Olig2 ChIP-Seq порівнювали з експресією генів у OPC з попередньої публікації 18. Ця стратегія може бути обмежена, оскільки механізми, що зв'язують експресовані гени в OPC, оскільки фактор транскрипції Olig2 можна контролювати. Крім того, фактор транскрипції Olig2 може пов'язувати генну регуляторну область, але ген може мати низький рівень експресії гена через можливі інгібуючі механізми або відсутність ко-факторів, необхідних для транскрипції генів.
ChIP-Seq - метод, який використовується для ідентифікації місць зв’язування ДНК для геномних факторів транскрипції та інших білків. Однак, аналізуючи одночасне виникнення факторів транскрипції, дослідники виявили, що фактори транскрипції, як правило, асоціюються з іншими білками, що утворюють Co Модуль 33. Це означає, що деякі зв’язки між транскрипційними факторами та геномною ДНК, виявлені ChIP-Seq, є непрямими та пов’язаними з іншими білками. Отже, для отримання більш значущих результатів дослідникам слід одночасно вивчати множинні фактори транскрипції.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Розкриття інформації
Автори заявляють, що у них немає фінансових конфліктів інтересів.