Ідентифікація та характеристика варіантів ATP13A2 та їх актуальність для

Ідентифікація та характеристика варіантів ATP13A2 та їх значення для нейродегенеративних захворювань Інавгураційна дисертація на здобуття докторського ступеня факультету математики та природничих наук Університету Кельна, представлена ​​Андре Хаймбахом з Ессена Кельн 2009

ідентифікація

Ця дисертація була підготовлена ​​з схвалення факультету математики та природничих наук Кельнського університету в Інституті генетики людини (директор: проф. Д-р Брунгільда ​​Вірт) Кельнського університету під керівництвом проф. Торстен Гоппе та проф. Крістіан Кубіш зробив. Рецензент: проф. Д-р Торстен Гоппе Проф. Крістіан Кубіш День останнього усного іспиту: 12 січня 2010 р

Зміст Зміст Зміст Список абревіатур 1 Вступ 1 1.1 Нейродегенеративні захворювання 1 1.1.1 Паркінсонізм 1 1.1.2 Синдром Куфор-Ракеба та ATP13A2 5 1.2 АТФази типу P 6 1.2.1 Транспортування матеріалу через біологічні мембрани 6 1.2.2 АТФ-насоси 6 1.2.3 Структура АТФаз типу P 7 1.2.4 Функціональний механізм АТФаз типу P 8 1.2.5 Класифікація АТФаз типу P 10 1.2.5.1 АТФаз типу I 11 1.2.5.2 АТФаз типу II 11 1.2.5.3 АТФаз типу III 11 1.2. 5.4 АТФази типу IV 12 1.2.5.5 АТФази типу V 12 1.2.6 Мутації в АТФазах як причина захворювань 13 1.3 Цілі роботи 15 2 Матеріали та методи 16 2.1 Хімічні речовини 16 2.2 Витратні матеріали 16 2.3 Загальні розчини 16 2.4 Ферменти 17 2.5 Системи комерційних реагентів ( Набори) 17 2.6 Дезоксирибонуклеотидні трифосфати (dntp) 17 2.7 Вектори клонування 18 2.8 Пристрої, що використовуються 18 2.9 Бази даних та інші веб-сайти 19 2.10 Програмне забезпечення 20 2.11 Молекулярно-біологічні методи 20 2.11.1 Ланцюгова реакція полімерази (ПЛР) 20 2.11.2 Дизайн праймера 20 2.11.3 Партії реакцій ПЛР 21 I

Список абревіатур Список абревіатур A абсорбція A аденін AA амінокислота A. дистильована вода Рис. Рисунок AK антитіло ABI Applied Biosystems AP лужна фосфатаза ATP аденозин трифосфат BAC бактеріальна штучна хромосома BCA біцинхонінова кислота (біцинхонінова кислота; 2,2-хінолін-4,4-бікарбоксильна пара) BSA бичачий сироватковий альбумін (бичачий сироватковий альбумін) C цитозин cdna ДНК копія РНК комп-гета з'єднання-гетерозиготний DAPI 4 6-диамидино-2-фенилидол ddntp дидезоксинуклеотид трифосфат Del Deletion DMEM Dubecco s Modified Eagle s Medium DMSO диметилсульфоксид DMNO 5 трифосфатів dpc днів після коітуму DTT Dethiothreitol E. coli Escherichia coli EDTA Етилендіамінтетраоцтова кислота EF ембріональні живильні клітини (мишачі) ER ендоплазматичний ретикулум ES ембріональні стовбурові клітини (мишачі) F прямий праймер (праймер у прямому напрямку) F від F c FKS G. G антигензв’язувальний Фрагмент антитіла постійна частка антитіла f етанова теляча сироватка гуаніну, грами V

Список скорочень h година HCl соляна кислота HEK ембріональна нирка людини (ембріональні клітини печінки людини) het heterozygot hom homozigous HRP пероксидаза хрону (пероксидаза хрону) H 2 O вода IgG імуноглобулін із групи G IgM імуноглобулін із групи M IHF інтеграція фактор господаря J Joule k kilo kb кілобаз пар kda кідальтон КО вибиває синдром KRS Kufor-Rakeb 1 літр LAMP лізосома, асоційований з білком мембрани LB Luria Bertani m milli (фактор 10-3) M molar ma milli-ampere Mb megabase пары хв хвилин MMC mytomycin C MOPS 3-N-морфоліно-пропансульфонова кислота MPTP 1-метил-4-феніл-1,2,3,6-тетрагідропіридин МТТ 3- (4,5-диметилтіазол-2-іл) -2,5-дифенілтетразолій бромід н нано (фактор 10-9) N нормальний розчин NaCl NADH нікотинамід аденин динуклеотид NADPH нікотинамід аденін динуклеотид фосфат NaOH розчин гідроксиду натрію Neo неоміцин OD n оптична щільність (поглинання на довжині хвилі n нанометрів) p pico (фактор 10-12) VI

Список абревіатур PAA PAGE PCR PD PDI ph PIC R rh RNase rpm RT SDS sec T TAE Taq TE TM UPS UV V WT w/v поліакриламід поліакриламід гель електрофорез полімеразна ланцюгова реакція хвороба Паркінсона (хвороба Паркінсона) білок дисульфід ізомераза негативні декадичні логарифмічні показники дегідного логарифму водневого логарифму -Інгібітор коктейльного зворотного праймера (праймер у зворотному напрямку) відносна вологість (відносна вологість) обороти рибонуклеази в хвилину (обороти в хвилину) кімнатна температура додецилсульфат натрію секунди тимін трис-ацетат-ЕДТА Thermus aquaticus Трис-ЕДТА трансмембранний доменний блок - визначена одиниця активності ферменту убиквітин- Система протеасом ультрафіолетове вольт воля дикого типу на обсяг VII

Матеріал та методи 2. Матеріал та методи 2.1 Хімічні речовини Хімічні речовини, органічні речовини та розчинники із позначенням якості для аналізу були використані та отримані у таких компаній: Amersham (Freiburg) AppliChem (Дармштадт) BD Biosciences Clontech (Heidelberg) Calbiochem (Darmstadt) Difco Lab (Sparks/США) Fermentas Life Sciences (St. Leon-Rot) Fluka (Taufkirchen) GE Healthcare (Мюнхен) Invitrogen (Карлсруе) Merck (Дармштадт) New England Biolabs (Франкфурт-на-Майні) Перкін Елмер (Массачусетс/США) Пірс (Рокфорд)/США) Рош (Мангейм) Зігма-Олдріх (Тауфкірхен) 2.2 Витратні матеріали Пластмасові вироби та реакційні посудини були отримані від фірм Greiner (Frickenhausen) та Sarstedt (Nümbrecht). 2.3 Загальні розчини Якщо в протоколі не зазначено інше, для всіх буферів, розчинів та середовищ використовували дистильовану воду (A. dest). TE буфер (ph 8) 10 мм Tris-HCl 1 мм EDTA ad 500 мл HPLC-H 2 O, стерильний фільтр, зберігання при -20 C TE -4 буфер (ph 8) 10 мм Tris-HCl 0,1 мм Na 2 -EDTA стерильний фільтр, зберігання при -20 C 10 X PBS (ph 7,4) 80 г NaCl 2 г KCl 14,4 г Na 2 HPO 4 2,4 г KH 2 PO 4 автоклав до 1 л H 2 O, Зберігання при RT 16

Матеріал та методи 2.7 Вектори клонування Таблиця 2.2: Вектори, що використовуються (векторні карти у додатку) Назва Опис Розмір [bp] Джерело pcdna 3.1 V5/вектор його експресії 5523 Invitrogen pdonr221 Вектор клонування 4762 Invitrogen pcdna-dest53 Вектор експресії 7767 Invitrogen PPNT targeting vector 7200 AG Zimmer pdr -Vektor 7314 AG Brüning 2.8 Пристрої, що використовуються Табл. 2.3: Застосовані технічні пристрої Модель приладу Виробник Автоклав Паровий стерилізатор Варіоклав H + P Лабораторна технологія Інкубатор Hera Cell 150 Камера для термофорезу Sub-Cell GT Bio-Rad X-Cell Sure Lock Пристрій для електропорації в азоті Ген Пульсер Система Biorad Ємність Подовжувач Розробна машина Biorad Curix 60 Agfa Гейгера лічильник LB 124 Система документування гелю Berthold Chemidoc XRS Biorad нагрівальна/перемішувальна плита MR 3001 Шафа для гібридизації Heidolph тип 30 Спеціальний інкубаційний шейкер Hyb Bachofer Innova 44 мікроскоп Axioplan2 Zeiss нуклеїнова кислота/вимірювач білка Nano Drop ND-1000 New Brunswick С. науковий вимірювач рН PeqLab inolab ph рівень 1 Дозатор для піпетування WTW Дослідження Eppendorf Система ПЛР у режимі реального часу Easypet 7500 Система ПЛР у режимі реального часу (Taq-Man) Eppendorf система надчистої води Milli-Q; Q-Gard 2 Millipore Roller Shaker Roller Mixer SRT 1 Stuart Applied Biosystems 18

Матеріали та методи Секвенсер ABI Prism 3100 Генетичний аналізатор Прикладні біосистеми Пристрої напруги Power Ease 500 Invitrogen Power Pac Basic Bio-Rad стерильний робочий стіл Hera Safe KS 12 Kendro Thermoblock Heatblock II VWR Thermocycler льодяник Biorad Gene Amp PCR System 9700 Applied Biosystems Thermomiorf IKA Benchtop Centrifuge Galaxy Mini VWR Transfer Module X-Cell II Blot Module Invitrogen Ultrasonic Bath USC 100T VWR Ultracentrifuge Avanti J 20 XPi Beckman Coulter UV Crosslinker CL-1000 UV Crosslink UVP UV Chamber GS Gene Linker UV Chamber Bio Rad Vortex Reax Top Heidolph Waage Acculab Баланс Vicon Sartorius (прецизійний баланс) ARJ 120-4M Кернова водяна ванна WB22 Центрифуга Memmert Центрифуга 5415D Центрифуга Eppendorf 5415R Eppendorf Allegra X-22R Beckman Coulter Varifuge 3.0 RS Kendro 2.9 Бази даних та інші веб-сайти BACPAC Resources Center BDGP BioTools3: wwwtacg. NEB P-Type ATPases UCSC Vector Designer http://bacpac.ch ori.org/ http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html http://biotools.umassmed.edu/tacg/wwwtacg.php http://www.cbs.dtu.dk/services/ http: //www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.neb.de http://biobase.dk/

exe/patbase.html http://genome.cse.ucsc.edu/index.html https://vectordesigner.invitrogen.com/login.cfm 19