Інгібування експресії гена ICAM-1 олігонуклеотидами потрійної спіралі - PDF Безкоштовно завантажити

З клініки та поліклініки дерматології та алергології Університету Людвіга Максиміліана в Мюнхені Директор: проф. мед. Лікар. hc.c. Г. Плевіг Інгібування експресії гена ICAM-1 олігонуклеотидами потрійної спіралі Дисертація на здобуття докторської ступеня з біології людини на медичному факультеті Університету Людвіга Максиміліана в Мюнхені, представлена ​​Робертом Бешем з Мюнхена 2003 р.

гена

З дозволу медичного факультету Мюнхенського університету Доповідач: проф. К. Дегіц 2. Доповідач: проф. Д-р. П. Б. Беккер Співрепортер: Нагляд співробітника доктора: декан: Priv.-Doz. Г. Хартманн проф. Д-р Th. Brocker Dr. C. маршал проф. Д-р Лікар. hc.c. К. Петра День усного іспиту: 28 липня 2003 р

Інгібування експресії гена ICAM-1 олігонуклеотидами потрійної спіралі

Частини цієї роботи є частиною наступної публікації: Besch, R., Giovannangeli, C., Kammerbauer, C., Degitz, K. Специфічне інгібування експресії ICAM-1, опосередковане геном, націленим на триплекс-утворюючі олігонуклеотиди J. Biol. Chem. 2002; 277: 32473-32479

Зміст ВСТУП 1. Відкриття структур потрійної спіралі. 1 2. Інгібування генів олігонуклеотидами. 2 2.1 Інгібування гена олігонуклеотидами з потрійною спіраллю. 2 2.2 Інгібування генів антисмисловими олігонуклеотидами. 3 3. Будова потрійної спіралі. 4 4. Цільові послідовності для олігонуклеотидів з потрійною спіраллю. 5 5. Олігонуклеотиди з потрійною спіраллю. 6 5.1 Основні аспекти проектування олігонуклеотидів з потрійною спіраллю. 6 5.1.1 Орієнтація базових триплетів. 6 5.1.2 Кути зв’язку та довжини базових триплетів. 7 5.1.3 Властивості та стійкість окремих базових триплетів. 8 5.2 Олігонуклеотиди з потрійною спіраллю. 8 5.2.1 Олігонуклеотиди потрійної спіралі піримідинового типу. 9 5.2.2 Олігонуклеотиди потрійної спіралі пуринового типу. 9 6. Модифікації олігонуклеотидів потрійної спіралі. 10 6.1 Модифікація основ. 10 6.2 Модифікація магістралі. 10 6.3 Модифікація торців. 11 7. Технологія потрійної спіралі. 13 7.1 Біологічна активність олігонуклеотидів з потрійною спіраллю. 13 7.2 Докази утворення потрійної спіралі. 14 1 Зміст

8. Молекули клітинної адгезії. 14 надсімейств імуноглобулінів. 15 інтегринів. 16 селектинів. 16 кадгеринів. 17 9. Молекула адгезії клітини ICAM-1. 17 9.1 Виникнення та регулювання ICAM-1. 17 9.2 Імунологічна функція ICAM-1. 18 9.3 Медичне значення інгібування ICAM-1. 19 9.3.1 Запальні захворювання шкіри. 20 9.3.2 Інші запальні захворювання. 9.3.3 Захист від відторгнення трансплантованих органів. 21 9.4 Структура білка ICAM-1. 22 9.5 Генна структура ICAM-1. 23 МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ 1. Матеріали. 24 1.1 Хімічні речовини та розчинники. 24 1.2 Ферменти. 25 1.2.1 Ферменти обмеження. 25 1.2.2 Інші ферменти. 25 1.3 Антитіла. 25 1.4 Плазміди. 26 1.5 Біологічний матеріал. 26 1.5.1 Клітини прокаріотів. 26 1.5.2 Еукаріотні клітини. 26 1.6 Середовище та добавки для культивування еукаріотичних клітин. 26 2 Зміст

1,7 олігонуклеотиди. 27 1.7.1 Потрійна спіраль та контрольні олігонуклеотиди. 27 1.7.2 Олігонуклеотиди, що використовуються для отримання послідовностей-мішеней 27 1.7.3 Олігонуклеотиди, що використовуються як праймери. 28 1.8 Повні комерційні системи. 29 1.9 Витратні матеріали. 29 1.10 Пристрої. 30 1.11 Програмне забезпечення. 30 2. Методи. 31 2.1 Методи ДНК. 31 2.1.1 Загальне поводження з нуклеїновими кислотами. 31 2.1.1.1 Очищення ДНК шляхом фенольної екстракції. 31 2.1.1.2 Осадження ДНК. 31 2.1.1.3 Гель-електрофорез з агарозними гелями. 31 2.1.1.4 Денситометрична оцінка смуг ДНК. 32 2.1.1.5 Виділення фрагментів ДНК з агарозних гелів. 32 2.1.1.6 Очищення ДНК силікатними мембранами. 33 2.1.1.7 Визначення концентрації нуклеїнових кислот. 33 2.1.2 Приготування геномної ДНК з клітин А431. 33 2.1.2.1 Отримання геномної ДНК з аніонообмінними колонками. 34 2.1.2.2 Приготування геномної ДНК за допомогою силікатних мембранних колон. 34 2.1.3 Полімеразна ланцюгова реакція. 2.1.4 Позначення нуклеїнових кислот дигоксигеніном (DIG). 36 2.1.4.1 Внутрішнє маркування нуклеїнових кислот. 36 2.1.4.2 Позначення 3 кінців нуклеїнових кислот. 36 2.1.5 Перенесення нуклеїнових кислот у нейлонові мембрани (промокання). 37 2.1.6 Гібридизація ДНК з міченими DIG зондами (Сазерн-ляпти). 37 2.1.7 Виявлення DIG-мічених нуклеїнових кислот. 37 3 Зміст

2.5 Докази потрійної спіралі. 51 2.5.1 Затримка гелю. 51 2.5.2 Інгібування ферментів рестрикції. 52 2.5.3 Інгібування реакції ПЛР. 52 2.5.4 Виявлення потрійних спіралей за допомогою магнітного розділення. 53 2.5.4.1 Потрійне виявлення спіралі на ізольованій геномній ДНК. 54 2.5.4.2 Виявлення потрійної спіралі в ядрах клітин. 55 РЕЗУЛЬТАТИ 1. Цільові послідовності олігонуклеотидів з потрійною спіраллю в гені ICAM-1. 56 1.1 Ідентифікація відповідних цільових послідовностей. 56 1.2 Вибір особливо придатних цільових послідовностей. 57 2. Конструювання олігонуклеотидів з потрійною спіраллю. 59 2.1 Потрійні спіральні олігонуклеотиди для цільової послідовності 13. 59 2.2 Потрійні спіральні олігонуклеотиди для цільової послідовності 17. 61 2.3 Конструкція контрольних олігонуклеотидів. 62 3. Дослідження прихильності. 63 3.1 Дослідження зв’язування з олігонуклеотидами з потрійною спіраллю для цільової послідовності 13. 63 3.1.1 Дослідження зв’язування з олігонуклеотидними цільовими послідовностями. 63 3.1.2 Дослідження зв'язування на плазміді. 65 3.1.2.1 Виробництво плазміди pcm55 з цільовою послідовністю 13. 65 3.1.2.2 Потрійне виявлення спіралі шляхом інгібування EcoN I. 66 3.1.3 Дослідження зв’язування препаратів геномної ДНК. 69 3.1.3.1 Інгібування ферменту рестрикції Bfa I. 69 3.1.3.2 Виявлення потрійної спіралі за допомогою магнітного розділення. 70 3.1.4 Дослідження зв’язування препаратів ядер клітин. 72 3.2 Дослідження зв’язування з олігонуклеотидами з потрійною спіраллю для цільової послідовності 17. 76 5 Зміст

3.2.1 Дослідження зв'язування цільових послідовностей олігонуклеотидів. 76 3.2.2 Дослідження зв'язування на плазмідах. 79 4. Біологічна активність олігонуклеотидів потрійної спіралі. 81 4.1 Інгібування експресії ICAM-1. 81 4.1.1 Встановлення умов трансфекції олігонуклеотидів 81 4.1.2 Інгібування ICAM-1 TFO13GT. 82 4.1.3 Інгібування ICAM-1 btfo13cu. 86 4.1.4 Дослідження цитотоксичних ефектів. 87 4.2 Інгібування репортерних генів. 89 4.2.1 Клонування репортерної плазміди. 89 4.2.2 Інгібування експресії CAT та вплив UVA-випромінювання. 92 4.2.3 Додаткові дослідження з метою доведення потрійного спірального опосередкованого інгібування генів 94 ОБГОВОРЕННЯ 1. Зв'язуюча здатність олігонуклеотидів потрійної спіралі. 96 1.1 Дослідження олігонуклеотидів, що містять послідовності-мішені. 96 1.2 Дослідження на плазмідах, що містять цільові послідовності. 98 1.3 Дослідження геномної ДНК. 99 2. Інгібування ICAM-1. 102 3. Активність олігонуклеотидів потрійної спіралі в модельній системі. 105 4. Вплив UVA-випромінювання на інгібування генів олігонуклеотидами з потрійною спіраллю. 106 5. Перспектива. 108 РЕЗЮМЕ. 110 СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ. 113 ДОДАТОК. 126 6 Зміст

9.5 Структура гена ICAM-1 Ген ICAM-1 складається з 7 екзонів, які перериваються 6 інтронами (рис. 11). Exon Intron Promoter 1 2 3 4 5 6 7 1000 bp Рис. 11: Ген ICAM-1. Пропорційне представлення гена ICAM-1, екзони виділені як нумеровані поля. Райони в першому та другому вступних повідомленнях, які не були опубліковані на момент написання статті, позначаються скісними рисками. Загальна довжина першого інтрона становить близько 4 кб, другого інтрона більше 2,6 кб. Перекладена область відображається сірим кольором, а неперекладені білим кольором. За винятком кількох незначних перекриттів, кожен імуноглобуліноподібний домен білка кодується одним із приблизно 300 п.н. екзонів (Degitz et al. 1991). Позаклітинні домени 1-5 відповідають екзонам 2-6, тоді як трансмембранна та внутрішньоклітинна частини білка кодуються екзоном 7 (Voraberger et al. 1991). Сильна кореляція між геномною організацією та розподілом білка на домени характерна для надродини імуноглобулінів (Staunton et al. 1988). 23 Вступ

1.2 Ферменти 1.2.1 Рестрикційні ферменти 1.2.2 Інші ферменти Назвіть лужну фосфатазу з креветок Кленовський фрагмент ДНК-полімерази I Pwo-ДНК-полімераза (коректорна полімераза) T4 ДНК-лігаза Taq-ДНК-полімераза Термінальна трансфераза Джерело Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg) MBI Fermentas (St.Leon-Rot) пеклаб (Erlangen) Promega (Heidelberg) peqlab (Erlangen) Roche Diagnostics (Mannheim) 1.3 Ферменти рестрикції антитіл отримані від Roche Diagnostics (Mannheim), New England Biolabs (Schwalbach), MBI Fermentas (St.Leon-Rot ) або отримані від Hybaid-AGS (Гейдельберг). Специфічність Специфічність Маркування Джерело Джерело Людина ICAM-1 флуоресцеїн ізотіоціанат (FITC) MedSystems Diagnostics (Відень, Австрія) Людина HLA-DR R-Phycoerythrin BD Biosciences (Heidelberg) (PE) Миша IgG1 Флуоресцеїн Лотіохолеістерман Лохетхойяцель-бета-Іотіохотіанат-бета Мишачий IgG1 R-фікоеритрин (PE) BD Biosciences (Гейдельберг) 25 Матеріал і методи

1.4 Плазміди Початковими плазмідами для клонування репортерних плазмід були pcat ™ -Basic та psv ™ -β-галактозидаза Control (Promega, Heidelberg). Плазміда кДНК ICAM-1 (pg4h1), що складається з pgem ™ -4Z (Promega, Гейдельберг), в яку фрагмент кДНК ICAM-1 ICAM-1 з 2980 п.н. клонували за допомогою EcoR I і Sal I, походить від Staunton et ін. 1988. 1.5 Біологічний матеріал 1.5.1 Прокаріотичні клітини Escherichia coli (штам DH5α) використовували для реплікації плазміди. 1.5.2 Еукаріотичні клітини Всі експерименти проводили на клітинах A431, отриманих від ATCC (Роквілл, штат Меріленд, США). 1.6 Середовище та добавки до середовища для культивування еукаріотичних клітин Ім'я Назва Амфотерицин B Модифікований орел Дульбекко (DMEM) Фетальна теляча сироватка (FCS) Хенкс Буферний сольовий розчин (HBSS) L-Глютамін Пеніцилін Стрептоміцин Трипсин (0,25%)/Джерело життя ЕДТА (1 мМ) Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) ccpro (Neustadt/Weinstrasse) Life Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) 26 Technologies (Karlsruhe) 26 Матеріал і методи

2.2 Олігонуклеотиди потрійної спіралі для послідовності-мішені 17 Для послідовності-мішені 17 були розроблені антипаралельно зв'язуючі олігонуклеотиди потрійної спіралі пуринового типу. Вони складалися з гуаніну та аденину (TFO17GA, малюнок 25 A) або з гуаніну та тиміну (TFO17GT, малюнок 25 B). 3'-ТЕГ TFO17GA GGGGGGAAGGGAGGAAG псорален С6-5 '5'-CAGTTTTGGGGGGAAGGGAGGAATAAGGCCTC-3' 3 'GTCAAAACCCCCCTTCCCTCCTTATTCCGGAG-5' 3 'ТЕГ У TFO17GT GGGGGGTTGGGTGGTTG псорален С6-5', 5'-CAGTTTTGGGGGGAAGGGAGGAATAAGGCCTC-3 '3' GTCAAAACCCCCCTTCCCTCCTTATTCCGGAG- 5 'Рис. 25: Олігонуклеотиди з потрійною спіраллю TFO17GT і TFO17GA. На малюнку 25 A показано TFO17GA, який зв'язується антипаралельно з пуриновим ланцюгом цільової послідовності 17, а на малюнку 25 B показано TFO17GT, який також зв'язується антипаралельно. Обидва олігонуклеотиди зв'язуються з подвійною спіраллю з утворенням зворотних водневих зв'язків Хоогстіна. 5 кінців модифікували псораленом, 3 кінця - триетиленгліколем. Оскільки сайт 5 -TpA знаходиться на 3-му кінці гомопуринового сегмента, псорален був зчеплений з 5-кінцем олігонуклеотиду потрійної спіралі. Основний гуанін в олігонуклеотиді з потрійною спіраллю додавали до 5-го кінця, щоб привести псорален у положення, придатне для інтеркаляції. Вільні 3 кінці модифікували триетиленгліколем. 61 результат

2.3 Конструкція контрольних олігонуклеотидів Олігонуклеотиди зі змішаною послідовністю, які мають однакову довжину і такий же базовий склад, як відповідні олігонуклеотиди з потрійною спіраллю (скрембований контроль), служили контролями. Було обережно, щоб розподіл підстав був якомога подібнішим до асоційованих олігонуклеотидів потрійної спіралі. Для потрійної спіралі олігонуклеотиду btfo13cu, який може зв'язуватися лише в паралельній орієнтації, в якості контролю був розроблений олігонуклеотид з інверсованою послідовністю (обмінювались 3 та 5 кінці). На додаток до однакового складу, інвертовані олігонуклеотиди також мають однаковий розподіл підстав. Вони були позначені inv (для перевернутих). Також було забезпечено, що модифікації контрольних олігонуклеотидів відповідали модифікаціям олігонуклеотидів потрійної спіралі. Як і олігонуклеотиди з потрійною спіраллю, було забезпечено, що контрольні олігонуклеотиди не здатні до гібридизації з мРНК ICAM-1 (антисмислові ефекти). Послідовність усіх контрольних олігонуклеотидів з відповідними олігонуклеотидами з потрійною спіраллю, для яких вони використовувались, показана у розділі матеріалів (Розділ 1.7.1, сторінка 27). 62 результати

Якщо TFO17GA інкубували з плазмідою pg4h1 у (не калієвому) інкубаційному буфері та опромінювали, інгібування реакції ПЛР виявлялось із 100-кратного молярного надлишку олігонуклеотиду потрійної спіралі. Подальше збільшення кількості TFO не призвело до більшого гальмування. Слід зазначити, що реакція ПЛР запобігається лише в тому випадку, якщо обидва ланцюги ДНК були зшиті (бісадукти), оскільки у випадку моноадуктів протилежний ланцюг ампліфікації ПЛР все ще доступний. Тому повне інгібування ПЛР реакційної суміші малоймовірне. Якщо інкубація відбувалась в калієвмісному буфері, спостерігались подібні результати, при цьому інгібування виявлялося лише в 1000-кратному надлишку TFO. Цей результат також збігається зі зменшеним утворенням потрійної спіралі в експериментах із відставанням гелю у присутності калію. Реакція ПЛР не гальмувалась без опромінення. Порівняння плазмідних смуг показало, що кількість використаної плазміди було приблизно однаковим у всіх партіях і що різниця в кількості продукту ПЛР базується на інгібуванні ПЛР, а не на різній кількості використовуваної плазміди. 80 результатів

4.1.3 Інгібування ICAM-1 btfo13cu Після того, як експресію ICAM-1 пригнічували антипаралельно зв'язуючим потрійним спіральним олігонуклеотидом TFO13GT, проводили експерименти з паралельним зв'язуванням btfo13cu. Цей олігонуклеотид також мав інгібуючу дію на ICAM-1 (рис. 47). ICAM-1 HLA-DR A необроблений E необроблений B IFNγ F IFNγ C btfo13cu G btfo13cu D bcoinvcu H bcoinvcu Рис. 47: Експресія HLA-DR та експресія ICAM-1 клітин A431 після трансфекції btfo13cu. Зліва показано фарбування міченим FITC антитілом до ICAM-1, праворуч - фарбування кон'югованим РЕ антитілом до HLA-DR. Клітини або не обробляли (Малюнок 47 A та E), обробляли IFNγ (Малюнки 47 B та F) або трансфікували перед обробкою IFNγ 2 мкм btfo13cu (Малюнок 47 C та G) або 2 мкм bcoinvcu (Малюнок 47 D та H) були. 86 результати