Інгібування геміканалів коннексину полегшує безалкогольний стеатогепатит у мишей

предметів

реферат

вступ

Безалкогольна жирова хвороба печінки (НАЖХП) є найпоширенішим хронічним захворюванням печінки з поширеністю в світі 25% 1. NAFLD представляє спектр захворювань, починаючи від стеатозу печінки і закінчуючи безалкогольним стеатогепатитом (NASH), фіброзом печінки, цирозом печінки і, нарешті, гепатоцелюлярною карциномою 2. Стеатоз печінки може бути спричинений підвищеним припливом жирних кислот із дієти з високим вмістом жиру, резистентністю до інсуліну, ліками та генетичними факторами. Таким чином, стеатоз характеризується накопиченням крапель ліпідів на основі тригліцеридів у цитозолі гепатоцитів 3. Печінковий стеатоз може перерости в NASH у відповідь на низку тригерів, таких як запальні цитокіни, адипокіни, активні форми кисню та стрес ендоплазматичного ретикулума .

Результати

Вплив TAT-Gap24 та TAT-Gap19 на активність щілинного з’єднання та реакції геміканалів коннексину

TAT-Gap24 та TAT-Gap19 імітують амінокислотну послідовність у внутрішньоклітинній петлі Cx32 та Cx43 відповідно. Було виявлено, що Gap19 зв'язується з С-кінцевою областю Сх43, тим самим порушуючи взаємодію між внутрішньоклітинною петлею та С-кінцевою областю, що, в свою чергу, інгібує відкриття 12 геміканалу Сх43. Вважається, що подібний механізм лежить в основі дії TAT-Gap24 на геміканалах Cx32. Для оцінки специфічності TAT-Gap24 і TAT-Gap19 для блокування геміканалів Cx, але не щілинних спайов, у культурах гепатоцитів щурів (n = 4, N = 4) проводили відновлення флуоресценції після аналізу фотовідбілювання (FRAP) . Зокрема, гепатоцити щурів піддавали впливу 20 мкМ TAT-Gap19, 20 мкМ TAT-Gap24, 50 мкМ карбеноксолону (CBX), відомого інгібітора Cx-каналів 17, або контролю транспортного засобу протягом 24 годин і 48 годин, 24 години після посіву. При використанні з 20 мкМ TAT-Gap24 та TAT-Gap19 не викликали цитотоксичності в культурах гепатоцитів первинної щури (додатково 1). CBX зменшив відновлення флуоресценції через 24 год (с

геміканалів

коннексину

Вплив TAT-Gap24 та TAT-Gap19 на експресію білка коннексину в печінці. Після 8 тижнів СНСН в черевну порожнину хірургічно імплантували осмотичний насос, забезпечуючи стійке вивільнення 1 мг/кг/день TAT-Gap24 (n = 11) або TAT-Gap19 (n = 12) або фізіологічного розчину (n =) 14 ) протягом додаткових 2 тижнів, поки дієта триває. Імуноблот-аналіз на Cx26 (21 кДа), Cx32 (27 кДа) і Cx43 (43 кДа) після поділу та промокання, після чого результати нормалізували до загального білкового навантаження. Зображення латок обрізаються. Повні довжини ляпками показані в Додатковому 4. Дані виражаються як середні значення ± SEM.

Вплив TAT-Gap24 та TAT-Gap19 на біометричні параметри, гістологію печінки та сироваткові трансамінази

Відносна вага жиру зросла більш ніж удвічі і становила у мишей, що годували CHFD (n = 14), порівняно з мишами, що годували ND (p 22. Усі бали були 0 в групі, що годували ND (n = 10), і був один Збільшення показника стеатозу (с

інгібування

Вплив TAT-Gap24 та TAT-Gap19 на біометричні параметри та гістологію печінки в NASH. Після 8 тижнів СНСН в черевну порожнину хірургічно імплантували осмотичний насос, який забезпечував стійке вивільнення 1 мг/кг/день TAT-Gap24 (n = 11) або TAT-Gap19 (n = 12) або фізіологічного розчину (n =) 14 ) протягом наступних 2 тижнів, продовжуючи дієту. a ) Тіло, жир та печінка мишей та відносна вага печінки та жиру. ( ) Стеатоз, лобулярне запалення, утворення балонів та оцінка NAS заснована на фарбуванні гематоксилін-еозином тканини печінки групи ND (перша панель), сольової групи (друга панель), TAT-Gap24 (третя панель) і TAT-Gap19 (четверта група) Панель) панель). Дані представлені як середнє значення ± SEM із * p

геміканалів

Вплив TAT-Gap24 та TAT-Gap19 на запальні цитокіни та окислювальний стрес у NASH. Після 8 тижнів СНСН в черевну порожнину хірургічно імплантували осмотичний насос, забезпечуючи стійке вивільнення 1 мг/кг/день TAT-Gap24 (n = 11) або TAT-Gap19 (n = 12) або фізіологічного розчину (n =) 14 ) протягом наступних 2 тижнів, продовжуючи дієту. ( a ) Рівні IFN-γ, IL-6, IL-1β, TNF-α та IL-10 у тканинах печінки та сироватці крові. ( ) Активність SOD, GR, GPx та каталази в тканині печінки. Дані представлені як середнє значення ± SEM із * p 27. Це також стосується глутатіонредуктази (GR), глутатіонпероксидази (GPx) та каталази як антиоксидантних ферментів 28. Насправді у мишей та людей, хворих на НАСГ, рівень глютатіону, СОД та каталази знижений 27, 29. Цікаво, що в печінці мишей, які годували ІХСН (n = 14), було виявлено вищий GPx (p 30,). Подібні ефекти (p 31. Для антигену лімфоцитів (LY) 86 відмінностей на рівні білка не виявлено (6 і додаткові 5).

коннексину

2,5 мкм M 12 зв'язується, дозволяючи пептиду захоплюватися і утримуватися внутрішньоклітинно. Вважається, що Gap24 реагує подібно до Cx32 18. Як миші NASH, що отримували TAT-Gap24, так і TAT-Gap19, демонстрували знижений рівень тригліцеридів, холестерину, IL-1β та більшу кількість СОД в тканині печінки. Крім того, TAT-Gap19 також знижував рівень ALT і TNF-α, тоді як миші, які отримували TAT-Gap24, мали нижчий рівень IFN-γ. - і мав рівень IL-6. Однак слід підкреслити, що неспецифічні ефекти як такі через відсутність контролю пептидів яєць не можуть бути повністю виключені з цього дослідження. Рівні активності СОД, каталази, GR та GPx зазвичай знижуються під час NASH 27, 29, оскільки надмірно продуковані активні форми кисню можуть безпосередньо розщеплювати антиоксидантні молекули та інгібувати активність антиоксидантних ферментів 44. Оскільки каталаза, GPx та SOD проявляють свою ферментативну активність у тісному взаємозв'язку 44, зменшення активності каталази та GPx може відображати компенсаторний механізм для підвищення рівня активності SOD.

Таким чином, інгібування геміканалів Cx може відкрити перспективи для встановлення нових терапевтичних стратегій лікування НАСГ.

Матеріали та методи

Тварини та лікування

Виділення та культивування гепатоцитів

Самці щурів Спраг-Доулі (лабораторії Чарльз Рівер, Бельгія) утримувались у контрольованих умовах навколишнього середовища з вільним доступом до їжі та води. Гепатоцити виділяли за допомогою двоступеневої процедури перфузії колагенази, включаючи очищення шляхом послідовного диференціального центрифугування, і життєздатність клітин оцінювали шляхом виключення трипанового синього. Життєздатні (≥ 85%) гепатоцити при щільності 0,56 × 10 5 клітин на см 2 у William's Medium E (Invitrogen, США), доповнений 7 нг/мл глюкагону, 292 мг/мл L-глутаміну, антибіотиками ( 7, 33 МО), накритий бензилпеніцилін натрію, 50 мкг/мл моносульфату канаміцину, 10 мкг/мл амфіциліну натрію і 50 мкг/мл сульфату стрептоміцину) і 10% фетальної бичачої сироватки. Через 4 год, 24 год і 48 год середовище культури клітин видаляли і замінювали середовищем без сироватки, що містить 25 мкм. г/мл гідрокортизону натрію гемісукцинат і 0,5. г/мл інсуліну доповнювали. Процедури утримання щурів, а також виділення та вирощування гепатоцитів були затверджені Комітетом з етики експериментів на тваринах Vrije Universiteit Brussel (проект № 14-210-1), і всі тварини були протестовані згідно з критеріями Керівництва з догляду та використання лабораторних тварин. ".

Відновлення флуоресценції після фотовідбілювання

Для аналізу FRAP через 24 години після посіву клітин, культивовані гепатоцити щурів піддавали впливу 50 мкМ CBX, 20 мкМ TAT-Gap24, 20 мкМ TAT-Gap19 або контролю транспортного засобу протягом 30 хвилин, 24 годин і 48 годин. Аналіз FRAP проводили, як описано раніше 37. Флуоресценція у вибіленій клітині виражалася як відсоток відновлення відносно базового рівня безпосередньо перед фотовідбілюванням. Подібний аналіз проводили на клітинах, вилучених з освітленої ділянки, для моніторингу фотовідбілювання поза цільової області. Значення відновлення для кожного експерименту нормалізували до відповідних умов управління транспортним засобом. Крім того, значення Y 0, плато, тау, періоди напіввиведення та рухомої частки були розраховані після підгонки нелінійної кривої.

Вимірювання позаклітинного аденозинтрифосфату

Позаклітинний вивільнений АТФ вимірювали за допомогою комерційного набору для аналізу люциферину/люциферази (Sigma, США), як описано раніше 37. TAT-Gap24 і TAT-Gap19 вперше інкубували при 37 ° С протягом 0 хвилин, 6 днів або 20 днів у класичному інкубаторі (Galaxy 170S, Нью-Брансвік, Німеччина). Потім первинні культури гепатоцитів щурів піддавали впливу 20 мкМ TAT-Gap24, 20 мкМ TAT-Gap19, 50 мкМ CBX або контролю носія протягом 30 хвилин. Ці експерименти проводили через 24 години після виділення первинних гепатоцитів.

Гістопатологічне дослідження

Зразки тканин печінки фіксували у 10% фосфатно-забуференному формаліні протягом 24 годин і вносили у парафіновий віск. Зразки були в 5. М-зрізи вирізали і фарбували гематоксилін-еозином для оцінки стеатозу, гепатоцелюлярного балонування, часточного запалення та NAS, як описано раніше 22. Ступінь стеатозу оцінювали за наступною 4-бальною шкалою, стеатоз 0 ступеня, за участю 66% гепатоцитів. Запалення часточки також оцінювали за 4-бальною шкалою, а саме за ступенем 0, без вогнищ; Клас 1, менше 2 зграй на поле × 20; 2 клас, 2-4 зграї на поле × 20; 3 клас, більше 4 зграй на поле × 20. Формування балонів гепатоцитів оцінювали за 3-бальною шкалою: 0, немає; 1, деякі балонні клітини; 2, будь-які/виступаючі балонні клітини. Для НАН особливості стеатозу, часточкового запалення та балона гепатоцитів поєднували зі значеннями від 0 до 8.

Аналіз амінотрансаміназ сироватки крові, тригліцеридів сироватки та печінки та холестерину

Ліпіди печінки екстрагували хлороформом/метанолом. Зокрема, тканину печінки гомогенізували в 1 мл 2: 1 розчину хлороформу/метанолу та струшували при 22 ° С протягом 1 години в термомешалці (Еппендорф, Німеччина). Зразки центрифугували при 5000 х g протягом 10 хвилин, після чого супернатант видаляли. Далі, 200 мкм. Додавали L дистильованої води і зразки центрифугували при 8000 х g протягом 5 хвилин. Придонну фазу сушили при 37 ° С протягом ночі. Перед аналізом ліпіди розчиняли в 400 мкл бутанолу (Sigma, США). ALT, AST, тригліцериди та холестерин вимірювали за допомогою хімічного аналізатора (Labmax 240, Labtest, Бразилія). Результати виражали в МО/л для АСТ і АЛТ, мг/дл для тригліцеридів і холестерину в сироватці крові та мкг/мг для тригліцеридів і холестерину печінки.

Аналіз запальних цитокінів печінки

Тканину печінки гомогенізували в буфері лізису з інгібіторами протеази (Roche, Німеччина). Гомогенати центрифугували при 14000 х g протягом 15 хвилин при 4 ° C, а концентрації білка в супернатантах визначали за методом Бредфорда 62, використовуючи комерційний набір (Bio-Rad, США) з бичачим сироватковим альбуміном як стандартом. Набори ELISA використовували для вимірювання рівнів IL-1β, IL-6, IL-10, IFN-γ та TNF-α (BD Biosciences, США) у печінці 63.

Аналіз антиоксидантних ферментів печінки

Аналіз всієї транскриптоми

Імуноблот-аналіз

Імуноблот-аналіз тканини печінки проводили, як описано раніше 63. Мембрани нітроцелюлози/PVDF інкубували протягом ночі при 4 ° C з первинним антитілом, спрямованим до Cx26 (розведення 1/1000), Cx32 (розведення 1/1000), Cx43 (розведення 1/1000), CD36 (розведення 1/250), оксидаза NADPH (Розведення 1/250) та LY86 (розведення 1/500) (Sigma, Бельгія) з наступною інкубацією протягом 1 години при кімнатній температурі з відповідними вторинними антитілами (розведення 1/1000 для Cx26, Cx32 та Cx43; 1/500 розведення для CD36, NADPH оксидаза та LY86) (Дако, Данія). Денситометричний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення Image Lab 5.0 (Bio-Rad, США). З метою напівкількісної оцінки сигнали нормалізували щодо загального білка, вимірювали гелями, що не містять плям, і виражали як відносні зміни порівняно з тваринами, що годували ND.

Статистичний аналіз

Кількість біологічних (n) та технічних (N) повторів для кожного аналізу варіюється і вказується при обговоренні результатів. Усі дані були виражені як середнє значення ± стандартна помилка середнього значення (SEM). Результати статистично обробляли одностороннім дисперсійним аналізом із пост-hoc корекцією Бонферроні. Всі дані були оброблені за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism6, значення ймовірності (p) менше 0,05 вважалися значущими.

день подяки

Автори хочуть подякувати Dinja De Win, Tineke Vanhalewyn, Paul Claes та Steven Branson за їх віддану технічну роботу. Ця робота була фінансово підтримана грантами Університету Сан-Паулу-Бразилія, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (грант FAPESP SPEC 2013/50420-6 та 2016/16182-9), Європейської дослідницької ради ( Початковий грант ERC 335476), Фонд наукових досліджень-Фландрія (гранти FWO G009514N та G010214N) та Університетська лікарня університету Vrije Brussel-Бельгія (“Віллі Гептс Фонд” UZ-VUB).

Додатковий електронний матеріал

Додаткова інформація

Зауваження

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь з нашими умовами використання та правилами спільноти. Якщо ви виявите щось образливе або не відповідає нашим умовам чи інструкціям, позначте це як неприйнятне.