Інтернет-журнал Laborjournal - вода на шляху
Карін Холлічер
Марбург: Молекули води є визначальними для зв’язків між білками та лігандами. Ось чому хіміки та фармацевти дуже пильно на них дивляться.
Нейтронна кристалографія, калориметрія, ентальпія, ентропія - ось такі крилаті слова, до яких буквально переходить читач статті Йоганнеса Шибела та його колег з Філіппського університету в Марбурзі (Nat. Commun. 9: 3559). Слова, які негайно натякають: тут все ускладнюється. "Наші статті майже завжди важко читаються", - говорить старший автор Герхард Клебе, який проводить дослідження в Інституті фармацевтичної хімії Університету Марбурга. "Але якщо ти прогризешся, ти справді щось отримаєш". Гаразд, ми приймаємо запрошення.
Клебе та його колеги з робочої групи "Наркотики" хочуть оптимізувати активні фармацевтичні інгредієнти - і не лише з вчорашнього дня. У професійній кар'єрі Клебе майже все оберталося навколо освіти та вдосконалення ефектів наркотиків: вивчав хімію, один рік у джерела нейтронів у Греноблі, докторант з кристалографії, більше десяти років у BASF, з 1996 року в університеті Марбурга та автор високо оціненого підручника " Дизайн активних інгредієнтів ".
Білки також повинні усувати молекули води, щоб зв’язати ліганди. Фото: iStock/cactuseskimo
Остання публікація його робочої групи також стосується складних взаємозв’язків зв’язків між білками та лігандами, точніше з ферментами та інгібіторами. Експерименти складні - тому дослідники шукали "простий" білок: трипсин. Цей фермент належить до класу серинових протеаз і може інгібуватися N-амідинопіперидином та бензамідином.
Фармацевти та хіміки кажуть, серед іншого, що вода визначає, чи точно поєднуються дві молекули, як ключ і замок. Оскільки клітинні білки працюють у водному розчині і відповідно високо гідратовані, інтуїтивно очевидно, що ліганд, який хоче зв’язатися, повинен спочатку створити простір і перемістити кілька молекул води. Однак ця теза ще не була ретельно доведена експериментально. Принаймні підтвердження дав фермент тромбін, також серинова протеаза, яка важлива для згортання крові. Після того, як окремі молекули води були видалені зі зв'язуючої кишені тромбіну, поведінка зв'язування інгібіторів різко покращилася. Це відкриття призвело до розробки більш ефективних антикоагулянтів.
"Поки ми не знаємо, де знаходяться молекули води і як змінюється їх положення, наші знання про взаємодію між білками та їх зв'язуючими партнерами залишаються неповними", - пояснює Клебе. «Нам довелося використовувати методи до межі, щоб описати поведінку молекул води на трипсині». І з цим команда Марбурга та його колеги в Генуї, Юліху, Гамбурзі та Мюнхені заповнили 15 сторінок - плюс додаток!
Дослідження зв'язування розпочали з термодинамічних аналізів. Незважаючи на те, що давно відомо, що термодинамічні фактори мають вирішальний вплив на поведінку зв'язку, вони вивчені лише мало. Занадто складно. Формула, що використовується для опису термодинамічного процесу, коли зв’язуються дві молекули, виглядає дійсно просто: ∆G ° = ∆H ° - T∆S °.
∆G, різниця енергії Гіббса між вільним та зв’язаним станом, визначає реакцію. Ця різниця складається з різниці між ентальпією H ° та ентропією S °. Ентальпія - це всі енергії, що містяться в системі при постійному тиску. Ентропія описує стан порядку в системі. Згідно з другим законом термодинаміки, реакція відбувається добровільно, коли ∆S прагне до нуля, тобто G стає менше завдяки реакції.
Що це означає для білків і лігандів? Потужний зв’язок завжди пов’язаний з малою енергією Гіббса, тоді різниця ∆G між вільними та зв’язаними молекулами є явно негативною. Цю різницю в енергії можна довести як передачу тепла за допомогою ізотермічної титрувальної калориметрії (ITC). Партнери, що зв'язують, титрують при постійній температурі, а кількість тепла, яке утворюється при утворенні комплексу, вимірюють калориметром. Сьогодні калориметри настільки чутливі, що їх можна використовувати для виявлення кількості тепла в порядку величини мікрокалорій. Вимірювання тепла - це простий експеримент, і програмне забезпечення пристрою надійно забезпечує ∆H °, константу зв’язку, а отже, і енергію Гіббса. Але це ще не все. Міцний горіх - це оцінка: які атоми або зв’язки роблять, який внесок у яку енергію змінюється?
Якщо ліганд витісняє сильно закріплену молекулу води і виникають нові гідрофобні взаємодії, приріст ентропії більший, ніж якщо менш міцно зв’язана молекула води повинна поступитися. "Однак, на жаль, ентальпія та ентропія часто працюють один проти одного", - пояснює Клебе. Для того, щоб оптимізувати зв'язок, недостатньо модифікувати ліганд таким чином, щоб зменшувалася лише ентропія. "Ви повинні врахувати зміну відмінностей між ентропією та ентальпією".
У Марбурзі Тобіас Вульсдорф, хімік, що володіє інформаційними здібностями, справді випустив пар у системі термодинамічних формул зв'язку інгібітора трипсину. Він показав, що більш сильне зв'язування бензамідину порівняно з інгібітором піперидину є ентальпічно вигідним.
Щоб проілюструвати роль молекул води, автори визначили кристалічні структури. Зазвичай для цього використовують рентген. Однак, за словами Клебе, це недостатньо чутливо для точної локалізації молекул води. Саме тому вони використовували випромінювання від джерела нейтронів у Технічному університеті Мюнхена. Для нейтронної кристалографії потрібні дуже великі кристали білка. Робити це - це мистецтво. «Золотими пальцями» захоплюється Клебе, перший автор, а потім докторант Йоганнес Шибель створив кристали трипсину - з лігандами та без них. Клебе: «Найцікавіше в дифракції нейтронів полягає в тому, що випромінювання не руйнує кристали білка, і вимірювання можна перервати, а потім продовжити. Ми змогли вимірювати на кристалі тижнями - з перервами - і таким чином досягли роздільної здатності менше 1,5 Ангстрема. Це найкраще визначені нейтронні структури, які до цього часу проводились на білках такого розміру ".
Дізнайтеся більше про наші нові продукти та замовіть новий каталог 2021 сьогодні за адресою. більше
Але це ще не все: хіміки також визначали рентгенівські кристалічні структури. Великою проблемою було проведення рентгенівських вимірювань, таких як дифракція нейтронів при кімнатній температурі, щоб потім можна було порівнювати та комбінувати дані. Клебе: "Ми змогли розрахувати комбіновану структуру X-N (примітка редактора: X означає рентген, N - нейтрони) за даними рентгенівських та нейтронних даних та використати її з термодинамічними даними для комп'ютерного моделювання".
Команда виявила дев'ять молекул води навколо аспартату 189 у кишені для зв'язування трипсину. Три знаходяться безпосередньо в кишені трипсину, ще чотири більш-менш відстають від аспартату і служать "резервуаром", якщо одна з внутрішніх молекул втрачена. Що може легко статися, оскільки внутрішні молекули води не так щільно пов'язані лише двома водневими зв'язками, як зовнішні з трьома. Решта - трохи далі.
Дослідники Марбурга показали, що інгібітор витісняє молекулу води, коли вона зв'язується. В результаті орієнтація іншої молекули води змінюється: вона наближається до тирозину 228, створюючи новий водневий зв’язок. Як результат, він міцніше закріплений і більше не може вільно обертатися, що призводить до "ентропійного покарання", як пишуть автори. Ці та багато інших дуже детальних спостережень показали, які водневі зв’язки та гідрофобні взаємодії порушуються утворенням комплексів, а які знову утворюються. Клебе: "Ми вважаємо, що водні структури білка та зарядові стани аспартату відповідають за різну спорідненість двох інгібіторів до трипсину".
Досвід, який Клебе накопичив протягом багатьох років в університетах та в промисловості, не повинен використовуватись виключно у папері в майбутньому. У березні колишні співробітники Klebe за його підтримки заснували компанію CrystalsFirst. Метою є використання нової технології, відомої як "SmartSoak", для стабілізації кристалів білка, визначення їх тривимірної структури і, таким чином, проходження збору кандидатів на наркотики за допомогою програмного забезпечення. "Таким чином, геометричні дані, необхідні для сучасних фармацевтичних досліджень, можуть бути доставлені швидко і, перш за все, надійно на дуже ранній стадії пошуку наркотиків, а значні зусилля, пов'язані з пошуком наркотиків, значно зменшуються", - йдеться в прес-релізі засновника компанії. Подивимось, чи справдиться це.
(Неповна) робоча група хіміка Герхарда Клебе (спина, відкрита куртка) любить вирушати на екскурсію: вони особливо люблять кристали - чи то в печерах, чи то з білками. Фото: А. Г. Клебе