Клонування
Як щодо вашого клону? Хтось, хто встає вранці і ходить за вами до школи, робить домашнє завдання та прибирає кімнату, щоб у вас було достатньо часу для кінотеатру? Чудова ідея, а може, ні?
4. Інструменти клонування генів
Дослідники використовують різні молекулярні інструменти для клонування. Ферменти рестрикції (точніше ендонуклеази рестрикції), які можуть розпізнавати і розрізати ДНК у певних положеннях, є необхідними. Ферменти обмеження містяться в бактеріях, і їх можна порівняти з собаками-охоронцями: вони захищають бактерії від проникнення вірусів. Ферменти рестрикції розпізнають вірусну ДНК і розщеплюють її в процесі, який називається рестрикцією. Ферменти обмеження можуть розрізняти вашу власну та чужу ДНК, оскільки ваша власна ДНК хімічно позначена метильною групою, яка працює як прапор. Однак іноземна ДНК не має цього прапора.
Ферменти обмеження працюють надзвичайно конкретно: вони розпізнають короткі послідовності ДНК і в цей момент перерізають нитку ДНК. Рестрикційний фермент, який часто використовують дослідники в експериментах, називається Eco RI, першим рестрикційним ферментом, виявленим у бактерії кишкової палички (E. coli). Він розпізнає та розрізає послідовність GAATTC, залишаючи за собою так звані липкі кінці (див. Послідовність фільму "Технологія рекомбінантної ДНК"). Створені таким чином шматки (фрагменти) ДНК можна відносно легко зв’язати між собою (див. Рисунок 2.1).
На додаток до ферментів рестрикції, плазміди є ще одним засобом клонування. Плазміди - це «генні таксі»: вони можуть забирати чужорідну ДНК і передавати її бактеріям. Потім бактерії, наприклад, кишкова паличка, беруть на себе виробництво генів і білків. Бактерії кишкової палички є основними досліджуваними організмами в багатьох лабораторіях і є найбільш добре дослідженими живими істотами.
Щоб клонування працювало, дослідники використовують фокус: використовувані плазміди також мають ген, який надає бактеріям, які проковтують плазміду, стійкість до антибіотика ампіциліну. Цей опір виявиться важливим згодом.
У нашому експерименті фермент рестрикції Eco RI вирізає ДНК людини, яку ми отримали із зразка слини. Це створює тисячі шматочків ДНК - одна з яких містить ген інсуліну, який ми шукаємо. Ми використовуємо ті самі ферменти, щоб розрізати бактеріальні плазміди. Через липкі кінці ми можемо скласти окремі шматки назад. Багато плазмід нічого не підхоплять, багато хто відбирає ДНК людини, а деякі підбирають ген інсуліну, який шукають. Потім усі плазміди вводяться в бактерії E. coli.
Зараз ми розподіляємо всі бактерії на тарілці з живильним середовищем, на якому бактерії в принципі не можуть рости, оскільки в пластині міститься антибіотик ампіцилін. На цьому етапі пшениця відокремлюється від соломи: всі бактерії, які проковтнули плазміду, можуть рости на пластині і утворювати колонію, оскільки плазміда робить їх стійкими до ампіциліну. Бактерії розмножуються, а разом з ними і бажаний ген інсуліну.
На даний момент ми клонували тисячі фрагментів людської ДНК, причому не тільки тих, що нас цікавлять. Наступний крок - скринінг усіх колоній - дуже складний.
Як ми можемо знайти того, хто несе наш ген інсуліну від усіх тисяч клонів? Якщо ми вже знаємо частину послідовності ДНК гена інсуліну, то ми можемо отримати шматочок мРНК довжиною близько 30 пар основ, який буде стикатися з послідовністю генів інсуліну, як зонд. Цей зонд радіоактивний або мічений флуоресценцією, щоб ми могли визначити, з якими клонами він стикується. Завдяки цьому зонду ми знаходимо клон, який містить наш ген інсуліну (див. Малюнок 2.2). За допомогою цієї техніки можна клонувати багато інших генів, наприклад, для гормонів росту та інтерферону, генних продуктів, які також використовуються як ліки.
Клонування генів зараз успішно завершено, і стає зрозумілим, чому для цього використовуються бактерії, а не вищі організми: вищі організми розмножуються статевим шляхом. Для цих живих істот сексуальність має ту перевагу, що генетичний склад рекомбінований і що з нього з’являються нові особи з новими характеристиками. Це створює переваги в еволюції. Однак для дослідників ця нова генетична комбінація руйнує, оскільки може також змінити ген інсуліну.
Дослідникам доводиться працювати з тваринами, які генетично ідентичні: лише клони завжди реагують однаково в експерименті. Коли дослідники хочуть випробувати наркотик, вони завжди використовують мишей одного штаму. Такі штами мишей виводяться за допомогою інбридингу або тісно споріднені тварини схрещуються між собою.