Лабораторний журнал - Огляд продукції - Набори для очищення антитіл
В академічних дослідницьких лабораторіях антитіла часто очищають за допомогою афінних колон. Фото: Університет Флориди
(01.09.2020) Набори для очищення антитіл в основному засновані на невеликих спінових колонках або гранулах, які забезпечені білком А або G. Ізраїльська група розробила цікаву альтернативу без хроматографії.
Що було б у сучасних наукових дослідженнях про життя без поліклональних (pAb) або моноклональних антитіл (mAb)? Від нього не залишиться занадто багато, якщо ви проігноруєте всюдисущу ПЛР. Навряд чи існує експеримент чи аналіз, в яких маленькі помічники не брали участь і полегшували життя дослідникам або спочатку дозволяли проводити їх експерименти. Антитіла не тільки необхідні в базових дослідженнях для незліченних методів і протоколів, починаючи від імуноаналізів, вестерн-блот, ІФА та імуногістохімії до мікроскопії та візуалізації до проточної цитометрії. Вони також є важливими інструментами клінічної діагностики і все частіше використовуються як активні інгредієнти або терапевтичні антитіла для лікування різних захворювань.
Одним з найважливіших джерел поліклональних антитіл або імуноглобулінів (Ig) є плазма крові ссавців. Виходячи з ваги, близько двадцяти відсотків білків, які він містить, є антитілами, які поділяються на п'ять різних класів: IgA, IgD, IgE, IgG та IgM. Перші три також відіграють важливу роль в імунній системі, але IgG та IgM в основному використовуються для дослідницьких цілей. IgM з'являються на ранній фазі первинної імунної відповіді на антиген, тоді як IgG синтезуються у великих кількостях у подальшій вторинній імунній відповіді.
Дослідники цим користуються, вводячи антиген кроликам, козам, вівцям чи іншим ссавцям, а потім, як правило, виділяють та очищають IgG, що утворюються під час імунної відповіді, з плазми або антисироватки тварин. У віці до набору спочатку вони осаджували білки плазми сульфатом амонію, який вони додавали до кінцевої концентрації 25 відсотків. Після центрифугування та видалення білків настала черга IgG, які осаджували п’ятдесятивідсотковим сульфатом амонію.
Два етапи осадження та подальший діаліз розчину антитіла, отриманого для того, щоб позбутися сульфату амонію, проте вимагають великої ручної роботи та займають кілька днів. IgG можна виділити набагато швидше і простіше за допомогою наборів для очищення антитіл, які майже повністю засновані на невеликих споріднених колонках або гранулах, забезпечених білком А або білком G. Походить із золотистого стафілокока (білок А) та Streptococcus sp. Поверхневі білки, отримані з (білка G), з високою специфічністю зв'язуються з Fc-частиною багатьох IgG.
Хоча білок G має високу спорідненість до більшості IgG, протеїн A є трохи більш вибагливим і навряд чи його приваблюють IgG від хом'яків, щурів чи овець, наприклад. Для афінного очищення варіанти рекомбінантно експресованих білків A і G приєднують до хроматографічних смол або окремо, або іноді в поєднанні, або пов'язані з поверхневим матеріалом магнітних гранул. Часто одного етапу хроматографії достатньо для досягнення чистоти виділених антитіл понад 98 відсотків.
У дослідницьких лабораторіях значно нестабільні IgM, які мають тенденцію до агрегації, часто очищаються за допомогою афінних колон. Тут використовується матриця зв’язування - не білок А або G, а манозозв’язуючий білок або маноза-зв’язуючий лектин (MBL), який здебільшого іммобілізований на агарозі.
Для більш масштабного очищення білки А і G або інші специфічні ліганди для афінної хроматографії є досить дорогим задоволенням. Тому виробники антитіл та фармацевтичні лабораторії здебільшого переходять на класичну іонообмінну хроматографію і заповнюють колонки, наприклад, набагато дешевшими аніонітами, такими як діетиламіноетил (DEAE) агароза, щоб отримати чисті IgG, IgM і, зокрема, моноклональні антитіла (mAb). Але навіть цим методам доводиться боротися із загальними недоліками хроматографічних методів очищення - такими як обмежена здатність зв'язування, великі витрати часу та дороге обслуговування пристроїв.
Тому деякі групи наполегливо працюють над альтернативами хроматографічним процесам, дотримуючись гасла, який звучить все частіше і частіше: Все, окрім хроматографії (ABC). Одну з цих концепцій очищення антитіл без хроматографії було представлено минулого року групою Гая Пачторника з Ізраїльського університету Аріель разом з колегами з Індії (MABS 11 (3): 583-92). Оскільки антитіла також можна очищати за допомогою гідрофобної хроматографії за взаємодією (HIC), Пачорнік припустив, що антитіла, мабуть, зв’язуються з гідрофобними смолами трохи сильніше, ніж інші водорозчинні білки. Отже, за його ідеєю, їх також потрібно було б захопити за допомогою гідрофобних агрегатів миючих засобів.
Співробітники Пачторника генерували агрегати, спочатку додаючи гідрофобний хелатор батофенантролін (Бато) до водного розчину Твін-20 і вихрово перемішуючи суміш. Це дало їм Твін 20 міцел, поверхні яких були прикрашені гідрофобною частиною молекул Бато. Потім вони змішали ці сконструйовані міцели з розчином сульфату заліза і знову завихрили. Потім подальша реакція протікала практично автоматично: іони Fe 2+ утворюють гідрофобні (Batho) 3: Fe 2+ комплекси з молекулами Batho, розташованими на фазовій межі між міцелами та водою, що призводить до зшивання міцел з утворенням гідрофобного Tween -20 одиниць свинцю.
Ізраїльтяни перевірили, чи придатні агрегати для очищення антитіл сумішшю поліклональних людських IgG, що містять лізат кишкової палички як штучне забруднення. Процедура очищення, яку вони використовували для цього, дуже проста: суміш антитіл інкубують протягом п’яти хвилин із заздалегідь виготовленими агрегатами Твін-20, а потім центрифугують протягом двох хвилин. Потім IgG можна виділити з агрегатів за кілька хвилин за допомогою 50-мілімолярного розчину ізолейцину (pH 3,8). Все це також працює у вільному від сироватки середовищі гібридоми, яке зазвичай використовується для виробництва моноклональних антитіл - а також у присутності бичачого сироваткового альбуміну (BSA), який також часто зустрічається в культуральних середовищах клітин для виробництва антитіл.
Оскільки і чистота IgG, виділених із агрегатами Твін-20, і вихід лише трохи гірші, ніж при афінній хроматографії з білком А, Пачторник переконаний, що його метод є реальною альтернативою звичайному очищенню. Він навіть міг передбачити, що він замінює стовпи білка А в очищенні терапевтичних антитіл.
Група Ана Сесілії А. Рокеса в Університеті Нова в Лісабоні уникає хроматографічного очищення антитіл комбінацією спорідненого ліганду, осадження та магнітних наночастинок (Biotechnol. J. DOI: 10.1002/biot.202000151).
Три окремі методики, звичайно, не нові. Що нового, однак, полягає в їх злитті, утворюючи те, що відоме як спорідненість магнітних опадів. В основному, це надзвичайно просто - найскладнішим етапом є отримання магнітних наночастинок, які оснащені триазиновим лігандом, який специфічно зв'язується з антитілами.
Потім частинки змішують з 20% PEG3350, який служить осаджувачем. Неочищений екстракт інкубують із сумішшю протягом години при 4 ° С і струшують на орбітальному шейкері. Потім протягом п’ятнадцяти хвилин застосовують магнітне поле, щоб відокремити осаджені магнітні частинки з прилиплими до них антитілами від супернатанту. Потім нейтральним розчином PBS антитіла обережно видаляються з наночастинок.
За допомогою цього методу команда Роке виділила поліклональні антитіла із сироватки людини із 50-відсотковим виходом та чистотою вісімдесяти відсотків. Португальці досягли ще кращих значень для очищення моноклональних антитіл.
(Перша публікація: H. Zähringer, Лабораторний журнал 9/2020, станом на серпень 2020 року, вся інформація без гарантії)
Останні зміни: 01.09.2020
© 1996-2020 Редакційний зміст: LJ-Verlag GmbH & Co. KG, Фрайбург, дизайн та програмування: Інтернет-агентство f + r, Фрайбург,
Зображення та графічні зображення - якщо не вказано інше - з відповідними авторами та фотографами.