Метод визначення очищеності сполучних речовин методом мікрофотографічного термофорезу без очищення білка

Резюме

Мікромасштабний термофорез (MST) може широко використовуватися для визначення афінності зв'язування без очищення цільового білка від клітинних лізатів. Протокол передбачає надлишкову експресію GFP-конденсованого білка, лізис клітин у неденатураційних умовах та виявлення сигналів HNR у присутності різних концентрацій ліганду.

Анотація

Кількісна характеристика взаємодій білків має важливе значення практично у всіх галузях наук про життя, особливо у відкритті ліків. Більшість доступних в даний час методів визначення D D вимагають доступу до цікавого білка, виробництво якого може бути трудомістким та дорогим для очищення. Ми розробили протокол, який дозволяє визначати спорідненість зв'язування за допомогою мікроскопічного термофорезу (MST) без очищення цільового білка від клітинних лізатів. Спосіб включає надлишкову експресію GFP-конденсованого білка та лізис клітин в неденатураційних умовах. Застосування методу STAT3-GFP, тимчасово експресованого в клітинах HEK293, дозволило вперше визначити спорідненість добре вивченого фактора транскрипції до олігонуклеотидів з різними послідовностями. Протокол є простим і може мати різноманітні програми для вивчення взаємодії білків з малими молекулами, пептидами, ДНК, РНК та білками.

Вступ

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

1. Приготування клітинного лізату

Цей протокол призначений для прикріплених клітин, що експресують злитий білок GFP. Кількість необхідних клітин може коливатися від мінімум 10 6 до менш ніж 20 x 10 6 клітин, залежно від рівня експресії білка. Наприклад, клітинний лізат HEK, який надмірно експресує GFP-STAT3, готували шляхом обробки клітин, вирощених у 10 колбах Т75, до приблизно 70% злиття 1 мл буфера для лізису. Однак цей лізат потрібно було розбавляти 150 разів, щоб забезпечити оптимальний рівень флуоресценції для експерименту MST. Протокол лізису клітин сильно залежить від властивостей та внутрішньоклітинної локалізації досліджуваного білка. Якщо використання миючих засобів небажано через нестабільність білка, найкращим вибором може бути ультразвук, описаний нижче. У буфер лізису можна додавати різні добавки, щоб уникнути реакцій модифікації білка: ЕДТА запобігає фосфорилюванню, ванадат натрію інгібує фосфатази білка тирозину, тому фторид натрію є інгібітором фосфатаз Ser/Thr.

2. Вибір та підготовка буфера MST

  1. Оскільки взаємодія білок-ліганд залежить від умов буферизації, склад буфера MST вибирається на основі властивостей певної системи. Як правило, корисно протестувати принаймні два різних тампони.
  2. Приготуйте 2 буфери MST 5x. Ми мали хороший досвід роботи з цими двома композиціями: HEPES (250 мМ HEPES, рН 7,4, 25 мМ MgCl2, 500 мМ NaCl, 0,25% NP-40) та Трис HCl (250 мМ Трис HCl, pH 7,4, 750 мМ NaCl; 50 мМ MgCl2, 0,05% Твін-20). Додавання BSA (5% у кінцевій сполучній суміші) може допомогти запобігти прилипанню білка до пластикових пробірок та скляних капілярів. Також можна очікувати, що NaN3 (0,5 мМ) запобігає ріст мікроорганізмів.

3. Визначення оптимального розведення лізату

  1. Виберіть світлодіодне джерело збудження з довжиною хвилі λ = 470 нм на приладі MST.
  2. Завантажте капіляри екстрактом ECll, розведеним у 2 і 10 разів, буфером MST.
  3. Виконайте операцію "Знайти капіляри" на програмному забезпеченні MST Instrument Control. Оптимальний діапазон флуоресценції в розведеному лізаті становить від 400 до 1500 одиниць флуоресценції.

4. Визначення оптимального діапазону концентрації ліганду

  1. Найвища концентрація ліганду повинна бути принаймні у 20 разів більшою за очікувану константу дисоціації.
  2. Нижня концентрація ліганду повинна бути нижчою за молярну концентрацію флуоресцентного білка.

Зверніться до інструменту пошуку NanoTemper Concentration Technologies для оцінки діапазону концентрацій ліганду.

5. Приготування клітинного лізату та розведення лігандів

  1. Поставте на кригу стійку для пробірок із необхідною кількістю (зазвичай 10-16) 0,5 мл пробірок для центрифуги LoBind. Внесіть 25 мкл буфера MST в дно кожної пробірки. Додайте 25 мкл основного розчину ліганду в першу ванну (№1, ліганд вищої концентрації) і послідовно виконуйте розведення ліганду двічі, використовуючи решту пробірок. Тримайте стійку з зразками лігандів на льоду.
  2. повільно розморожувати лізати клітин на льоду.
  3. Розведіть клітинний лізат буфером MST, щоб забезпечити оптимальний рівень флуоресцентного цільового білка в реакціях зв'язування. Кінцева концентрація білка повинна бути близько прогнозованої K D або менше. Він повинен бути відрегульований для отримання необхідної кількості флуоресценції в кінцевому розчині. Для визначення концентрації GFP-STAT3 у лізаті прилад відкалібрували за допомогою флуоресцеїну. Молярну концентрацію GFP у лізаті визначали із застосуванням співвідношення флуоресцеїну та EGFP відповідно, квантових виходів 0,85 та 0,61.

6. Мікромасштабний термофорез Дослідження зв’язку

7. Мікроаналіз даних термофорезу

Зв’язана частка (частка молекул у комплексі) = (Therm (C) незв’язана)/(зв’язана незв’язана), де Therm (C) - це термофорез, виміряна концентрація C, зв’язаний - термофорез для незв’язаного стану (коли молекули не знаходяться в складний), а зв’язаний - це термофорез для повністю зв’язаного стану.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Вимірювання спорідненості нефосфорильованого зв’язування білка STAT3 з олігонуклеотидами.

очищеності
Рисунок 1. Загальна схема експерименту. Натисніть тут, щоб збільшити малюнок .

Рисунок 2. Нетрансформовані дані термофорезу, створені для взаємодії GFP-STAT3 з багатим на АТ олігонуклеотидом. Розведений клітинний лізат, що містить 20 нМ GFP-STAT3, змішували зі зростаючими кількостями дволанцюжкових олігонуклеотидів (5'-AAAACAAAACGAAACAAACAAACTA) і давали зазначені концентрації ліганду. Дані збирали при 50% потужності лазера та 100% світлодіодах.

Рисунок 3. Крива прив'язки, сформована за допомогою програмного забезпечення для аналізу NanoTemper 1.2.231. Нормалізована флуоресценція (флуоресценція/тепла початкова флуоресценція) будується графіком щодо концентрації олігонуклеотидів. Білок демонструє збільшення флуоресценції в обмежувальному порівняно з незв'язаним станом. Дані монтуються за допомогою методу рівняння Хілла, включеного в програмне забезпечення для аналізу NanoTemper.

0541fig4highres.jpg "src ="/files/ftp_upload/50541/50541fig4.jpg "/>Малюнок 4. Зв'язування STAT3 з олігонуклеотидами з різними послідовностями. Мікромасштабні вимірювання термофорезного зв’язування STAT3-GFP з газом (KD = 37,9 ± 1,0 М), S 100 (KD = 23,3 ± 0,6 мкм), S +100 мутанта 1 (KD = 740 ± 21 вечора) та S +100 мутанта 2 (не є обов’язковим). Концентрацію STAT3-GFP підтримували постійною на рівні приблизно 20 нм, а концентрація олігонуклеотидів коливалась від 666 до 0,650 пМ. Різниця в нормалізованій флуоресценції [‰] наноситься на графік щодо концентрації олігонуклеотидів, і криві встановлюються за допомогою методу Хілл за допомогою програмного забезпечення для аналізу NanoTemper. Смужки помилок представляють стандартну похибку 3 вимірювань.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Експресія та очищення білків є трудомістким та дорогим етапом, який, однак, необхідний для визначення взаємодій K D найбільш часто використовуваним методом. Застосування ЗПСШ дозволяє уникнути очищення білка, що значно спрощує прискорення та кількісну характеристику взаємодій. Це має особливо важливі переваги у випадку, коли важко експресувати та очищати білки, такі як мембранні білки та фактори транскрипції.

Основним обмеженням та вимогою MST є здатність експресувати білок у синтезі із зеленим флуоресцентним білком. Однак конструкції для експресії більшості злитих білків GFP людини та миші є комерційно доступними. Злиті білки GFP також широко використовуються для досліджень торгівлі людьми та деградації, і тому можуть служити "подвійними функціями" в поєднанні з дослідженнями MST.

На додаток до відсутності потреби у очищенні білка, дуже економічного використання всіх реагентів та нечутливості до незначних змін буферних композицій, MST пропонує інші переваги перед традиційними методами визначення K D. На відміну від поверхневого плазмонного резонансу, експерименти на основі MST займають менше 2 годин, дозволяють визначати K D в більш широкому обсязі і не страждають від артефактів поверхневої іммобілізації. Наприклад, ми не змогли визначити K D для зв'язування STAT3 з олігонуклеотидами за допомогою SPR, хоча ми вклали значні кошти у придбання очищеного білка STAT3. K D взаємодії був занадто високим, що часто трапляється для факторів транскрипції, і виходив за межі концентрації експерименту SPR.

Титруюча калориметрія працює лише для взаємодій, що супроводжуються змінами в ентальпії. Це обмеження виключає багато випадків. Протягом цього часу зміни у термофоретичній рухливості, хоча і сильно відрізняються за значеннями окремих дисистем, відбуваються для переважної більшості взаємодій. Однією з найбільших переваг MST є те, що він працює в різноманітних буферах і переносить присутність миючих засобів, міцел та біцел в системі. Ця властивість дозволяє застосовувати до мембранних білків, які практично неможливо вивчити іншими способами. Однак слід дотримуватися обережності, щоб уникнути змін у миючому засобі та вмісті та складі міцел під час титрування лігандом.

Ефективність екстракції також може змінюватись для nt-диференційних білків залежно від внутрішньоклітинної локалізації та фізико-хімічних властивостей. Таким чином, корисно спробувати кілька умов лізису клітин та екстракції білка. Для цитоплазматичних білків, не використовуючи миючих засобів, будь-яке ультразвукове порушення клітин часто дає дуже добрі результати та дані. Тим часом мембранні білки вимагають більш широкого скринінгу умов екстракції з різною концентрацією та природою миючих засобів, ліпідних міцел або біцел. Вміст миючого засобу слід звести до мінімуму, щоб уникнути впливу спорідненості до зв'язування.

Незважаючи на цитовані обмеження, ми виявили дослідження MST нечищених GFP-конденсованих білків дуже зручними для кількісного визначення афінності зв'язування для багатьох типів білків та лігандів. Немає сумнівів, що поширення методу на багато лабораторій ще більше розширить застосування досліджень зв'язування білків на основі MST.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Розкриття інформації

Автори заявляють, що не мають конкуруючих фінансових інтересів. Зміст цієї публікації не обов'язково відображає погляди або політику Міністерства охорони здоров'я та соціальних служб, а також згадування торгових найменувань, торгових продуктів або організацій не означає схвалення уряду США.

Подяка

Ця робота була частково профінансована Програмою внутрішньошкільних досліджень NIH, Національним інститутом раку, Центром дослідження раку; угода про спільне дослідження між NCI та Calidris Therapeutics; Американське товариство раку IRG надає OT 97-152-17 та федеральні кошти від Національного інституту раку, NIH, за контрактом HHSN26120080001E.