Метод визначення рівня жиру в протоколі дрозофіли на основі плавучості (переклад німецькою мовою)

Резюме

Тут ми представляємо метод вимірювання рівня жиру в організмі у третьому личинковому віці (L3) личинкового періоду Drosophila melanogaster. Ця процедура використовує порівняно низьку щільність жирової тканини для розмежування личинок зі зміненим запасом жиру. Аналіз на плавучості є цінним інструментом для швидкого, відтворюваного та економічного скринінгу.

Вступ

Процедура виникає наступним чином із використанням різниці в щільності між жировою тканиною та нежирною тканиною. Жирова тканина ссавців має щільність близько 0,9 г/мл 14, тоді як скелетний м'яз має щільність 1,06 г/мл 15. Ця різниця означає, що тварини з більшими запасами жиру мають меншу щільність, ніж тварини з меншими запасами жиру. що дозволяють їм плавати у розчині з кращою щільністю твердої речовини. Ця властивість забезпечує надзвичайно швидкий скринінг великої кількості тварин, одночасно недорогий та неінвазивний. Аналіз на основі плавучості був використаний для підтвердження як фенотипів зміни відомих регуляторів рівня жиру, так і для виявлення нових генетичних та неврологічних регуляторів ожиріння 16,17.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

1. Збирайте яйця з руно з генотипами, що представляють інтерес

ПРИМІТКА. Ідеальні хрести складаються із 150 незайманих мух та принаймні 75 самців. На колекціях повинно бути не менше 200 мух.

2. Перекладіть личинок у експериментальну їжу

  1. Готуйте експериментальну їжу.
    ПРИМІТКА: Цей рецепт їжі заснований на середньому рецепті Bloomington Stock 18. Важливі зміни, що оцінюються, включають збільшення кількості дріжджів для оптимізації харчової цінності їжі шляхом хронометражу етапу ходьби (між 112-120 годинами після збору яєць при 25 ° C). Хоча ми визнали цей рецепт ідеальним для здоров’я та розвитку наших експериментальних личинок, рецепт їжі є прийнятним з урахуванням калібрування з позитивним та негативним контролем, приклади яких наведені в кроці 3.10.
    1. Відміряйте 1600 мл дистильованої води.
    2. Змішайте 134 г кукурудзяного борошна, 10,6 г агару дрозофіли типу II і трохи води (

    500 мл) у склянці об’ємом 1 л. Змішуйте протягом 2 хв за допомогою моторизованого ручного міксера. Змішайте 70 г живих сухих дріжджів, 18,4 г соєвого борошна, 84,8 г солодового екстракту і трохи води (

    3. Визначте рівень жиру у личинок

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Репрезентативні результати

    ілюстрація 1 показує приклад того, як аналіз на плавучості може виявити як більші, так і менші запаси жиру у личинок генно-інженерної інженерії. 1А показує, що стимуляція або замовчування певної підгрупи нейронів (E347) у мозку личинки спричиняє нижчі та вищі запаси жиру. В обох випадках застосовувався однаковий фоновий генетичний контроль. 1В показує приклад того, як цей фенотип, отриманий за допомогою аналізу щільності, підтверджується нейтральною екстракцією ліпідів та кількісною оцінкою за допомогою GCMS.

    визначення
    ілюстрація 1. Нейронна функція в певних областях мозку личинки необхідна і достатня для підшкірний жир - регулювання. Нейрологічна активність у зазначеній лінії E347-GAL4 замовчується надмірною експресією Shi DN або активується надмірною експресією NB, як зазначено на панелях, і оцінюється вплив на жир у організмі. (A) Відсоток личинок плаває в рівновазі в розчинах різної щільності. П'ятдесят личинок досліджували за біологічну реплікацію, n = 7 - 9 біологічних реплік для генотипу (B) Відсоток жиру в організмі (повністю нейтральні ліпіди, включаючи триацилгліцериди та фосфоліпіди, розділені на масу тіла), виміряні за GCMS 17.20 (n = 8). Синіми лініями або смужками представлені тварини, що перетинають w 1118 лише для GAL4 (без UAS) для впливу генетичного фону контролювати. Значення P представляють результати двосторонніх t-тестів. **** P 16 змінено. Клацніть тут, щоб побачити збільшену версію цього малюнка.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Обговорення

    Додатковою перевагою цієї техніки перед іншими є підвищена чутливість до незначних змін рівня жиру в популяції. При проведенні цілого градієнта концентрації в популяції 50 личинок, незначні зрушення в показниках жиру в популяції визначаються зміною середніх концентрацій, хоча концентрація личинок починає плавати і є повною, може не відрізнятися від контрольної плавав. Цей невеликий зсув популяції не завжди можна визначити іншими методами кількісного визначення жиру, оскільки вони вимагають аналізу великої групи личинок. З іншого боку, тест щільності запитує людей у ​​популяції і, отже, може виявити ці незначні зміни або зрушення в загальному розподілі популяції.

    Оскільки ця методика покладається на щільність розчину для отримання надійних результатів, надзвичайно важливо, щоб розчини PBS та сахарози виготовлялися послідовно. Ми виявили, що різні рецепти PBS дають різницю в щільності розчину і призводять до різних результатів. Ми будемо використовувати рецепт, описаний вище, для стабільних результатів. Крім того, виготовлення 20% сахарози з тієї ж партії 1х PBS є важливим, оскільки це призводить до того ж фону щільності розчину. Якби обидва розчини готувались окремо, незначні коливання щільності PBS могли б спричинити додаткові змінні щільності шляхом додавання сахарози до експериментальної конічної флакона. Нарешті, випаровування може бути проблемою, оскільки з часом, коли вода випаровується, розчини стають більш концентрованими. Тому важливо щільно закупорювати пляшки та переробляти розчин щотижня, щоб експериментальні розчини залишалися незмінними.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.