Методи вивчення зв’язування ліганду
Методи дослідження зв'язків лігандів Рівноважний діаліз Модуль Кінетика ферментів: Керівник: проф. Ганс Бісвангер Нагляд: Олена Кракер Протокол випробування: Пола Квеке Штефан Могк Сторінка 1 з 15
Зображення на обкладинці: Блок діалізу Ілюстрація схематична і не стосується продуктів, які насправді є на ринку. Показаний блок розділений на дві клітини, кожна з яких розділена мембраною на внутрішню та зовнішню камери. 1 Покажчик 1.1 Зміст 1 Покажчик. 2 1.1 Зміст. 2 1.2 Перелік рисунків. 2 2 Вступ. 3 3 Матеріал та методи. 3 3.1 Хімічні речовини та інструменти. 3 3.2 Тест на індол. 4 3.3 Рівноважний діаліз. 5 4 Експериментальна частина. 7 4.1 Калібрування індольного тесту. 7 4.2 Визначення часу діалізу. 8 4.3 Проведення рівноважного діалізу. 10 5 Короткий зміст та обговорення. 14 6 Література. 15 1.2 Список малюнків Рисунок 1: Фарбування індолом реактивом Ерліха. 4 Рисунок 2: Як працює рівноважний діаліз. 5 Рисунок 3: Можливі методи оцінки. 6 Рисунок 4: Калібрування індольного тесту. 8 Рисунок 5: Визначення часу діалізу. 9 Рисунок 6: Розподіл індолу (вимирання) після діалізу. 12 Рисунок 7: Розподіл індолу (концентрація) після діалізу. 12 Рисунок 8: Оцінка за допомогою прямого застосування. 13 Рисунок 9: Оцінка з використанням подвійного взаємного подання. 13 Рисунок 10: Оцінка Скетчарда. 14 Сторінка 2 з 15
Передача T = I/I 0 [] (1) Поглинання A = 1-T [] (2) Вимирання E = ε * c * d [] (3) E = log 1/T (4) ε: коефіцієнт вимирання c: Концентрація d: Товщина шару 3.3 Рівноважний діаліз Діалітична клітина розділена на зовнішню та внутрішню камеру напівпроникною мембраною певного розміру пор: Рисунок 2: Як працює рівноважний діаліз радіоактивно мічені відповідно до ліганду) в різних концентраціях. Мембрана проникна лише для низькомолекулярного ліганду (межа виключення ключових слів), градієнт концентрації збалансований за допомогою дифузії. Ліганд, пов'язаний макромолекулою, виводиться з рівноваги і замінюється лігандами, що надходять до тих пір, поки вільні частини ліганду в обох камерах не стануть однаковими. В рівновазі застосовується таке: [ліганд, зовні] = [ліганд, всередині, вільний] (5) [ліганд, всередині, загальний] = [всередині, вільний] + [всередині, зв’язаний] (6) 5 в 6 [Всередині, зв’язано] = [всередині, загалом] [ліганд, зовні] (7) сторінка 5 з 15
4 Експериментальна частина 4.1 Калібрування індольного тесту Для того, щоб можна було розрахувати концентрацію індолу за виміряною абсорбцією, було проведено ряд розведень із відомими кількостями індолу та проведено тестування індолу, як описано. Концентрації в діапазоні навколо константи дисоціації були навмисно обрані для серії розведення. Таблиця 1: Калібрування індольного тесту Індол 1: 100 KPP (1000 мкм) (0,1 М) V [мкл] V [мкл] c [мкм] E [] *) (572 нм) 0 250 0 0,000 5 245 20 0,041 10 240 40 0,082 15 235 60 0,110 20 230 80 0,159 (Kd = 100 мкм) 25 225 100 0,207 50 200 200 0,363 Концентрація в діапазоні 75 175 300 0,507 1/10 Kd