Мікрометастази в сторожових лімфатичних вузлах при раку шлунка - British Cancer Journal
Анотація
Головна
Матеріали і методи
Хірургічні зразки та препарат крові
Повний розмір таблиці
Всього 11 репрезентативних лімфатичних вузлів, що містять метастазований рак шлунка, та MKN-45, клітинна лінія раку шлунка, слугували позитивним контролем, а лімфатичні вузли у п’яти пацієнтів, які перенесли операцію з приводу неракових станів, як контроль. Далі 10 мл крові відбирали в пробірки, що містять цитрат натрію, і центрифугували з гіпотонічним розчином з градієнтом щільності, потім в крові збирали ядерні клітини. Ці лімфоцити периферичної крові від п’яти здорових донорів потім використовували як додатковий негативний контроль.
RT-PCR та тест Саузерн-блот
Імунозабарвлення
Усі зразки фіксували у 10% формаліні, вкладали у парафін і розрізали на серійні зрізи 4 мкм. Зразки імунофарбували на СК-18 методом комплексу авідин-біотин-пероксидаза. Після депарафінізації зрізи обробляли 0,3% перекисом водню в метанолі протягом 30 хв для блокування ендогенної пероксидази і промивали сольовим розчином, забуференним фосфатом. Потім зразки інкубували з нормальною козячою сироваткою протягом 30 хв для видалення неспецифічного фарбування та реагували протягом ночі при 4 ° C з моноклональним антитілом проти CK-18, розведеним 1: 100. мічений (мічений полімерний реагент) імуноглобулін (Dakopatts) застосовували протягом 60 хвилин як вторинні антитіла. Нарешті, для розвитку кольору був доданий діамінобензидин, а для ядерного фарбування - метиловий зелений. Для негативного контролю замість первинного антитіла використовували звичайний кролячий IgG.
Мікрометастаз
У цьому дослідженні мікрометастаз визначався як метастази, виявлені лише за допомогою RT-PCR та аналізу Саузерн-блот або імунозабарвлення.
Результати
Експресія мРНК маркера пухлини в контролях
Жоден з чотирьох маркерів мРНК, CK-18, CEA, hTRT або MUC-1, не був виражений в жодному з негативних контролів, а саме в лімфоцитах від п'яти здорових донорів та п'яти лімфатичних вузлах у пацієнтів без раку. CK-18 виражався у восьми (73%) з одинадцяти лімфатичних вузлів, що містять метастази раку шлунка, CEA у семи (64%), hTRT у шести (55%) та MUC-1 у шести (55%). Іншими словами, принаймні один маркер мРНК експресувався у всіх позитивних контролях. CK-18 та CEA змогли виявити клітину MKN-45 у 106 лімфоцитах, 10 клітинах hTRT та 100 клітинах MUC-1100 (рис. 1).
Чутливість RT-PCR та Саузерн-блот-аналіз маркерів мРНК на рак шлунка. У 106 лімфоцитах одну клітину клітинної лінії раку шлунка MKN-45 можна було виявити за допомогою CK-18 та CEA, 10 клітин - за допомогою hTRT та 100 клітин за допомогою MUC-1.
Повнорозмірне зображення
Експресія мРНК маркера пухлини в NS
З 213 СН, отриманих від 35 пацієнтів, вісім (4%) з п’яти пацієнтів містили метастази, виявлені за звичайною гістологією. Усі метастатичні відкладення мали той самий гістологічний тип, що і первинні. МРНК CK-18 експресувалася в 15 SN (7%), CEA у 12 (6%), hTRT у 10 (5%) та MUC-1 у 12 (6%). Принаймні один маркер мРНК був виражений на 25 вузлах (12%), взятих у шести пацієнтів (рис. 2). Вісім NS з метастазами, виявленими за звичайною гістологією, виражали принаймні один маркер мРНК в аналізах RT-PCR та Southern blot, тоді як 17 (8%) з 205 NS без гістологічно виявлених метастазів виражали принаймні один маркер MRNA (Таблиця 2).
Кількість метастазів, виявлених звичайною гістологією, фарбуванням гематоксиліном та еозином (H&E) та RT-PCR та тестуванням Саузерна на 213 сторожових вузлах. СК-18 = цитокератин-18; CEA = карциноембріональний антиген; hTRT = зворотна транскриптаза теломерази людини.
Повнорозмірне зображення
Повний розмір таблиці
Двоє з п’яти пацієнтів з метастазами в НС, виявлених за звичайною гістологією, також мали метастази в не-НС (Таблиця 3). І з 30 пацієнтів без метастазів у СН, виявлених за звичайною гістологією, один пацієнт із метастазами в СН, виявленими за допомогою RT-PCR та тестом Саузерн-блот, також показав метастази у не-СН, коли Імуноофарбовування використовують для CK-18. Всі метастатичні не-СН від цих трьох пацієнтів були ідентифіковані в тому ж лімфатичному басейні, що і метастатичний НС.
Повний розмір таблиці
Обговорення
Ми використовуємо ін’єкцію синього барвника для ідентифікації СН при раку шлунка з 1993 р. (Miwa et al, 2003). Якщо НС не містять метастазів, можлива малоінвазивна хірургічна операція без тривалого розсічення. Однак цей спосіб визначення показання до малоінвазивної хірургії має ряд недоліків. По-перше, деякі мікрометастази неможливо виявити за допомогою інтраопераційної патології або звичайної гістології. Друга проблема полягає в тому, як визначити відповідний ступінь дисекції лімфатичних вузлів у випадках, коли НС містять метастази.
На додаток до восьми метастазів, виявлених у 213 SN за звичайною гістологією, 17 додаткових мікрометастазів можна було виявити за допомогою RT-PCR та тесту Саузерн-блот. З цих 17 СН 15 спостерігали у п’яти пацієнтів з гістологічними метастазами в лімфатичні вузли і були присутні в тих самих лімфатичних тазах, що і метастатичні СН, виявлені за звичайною гістологією. Дві інші НС були виявлені у пацієнта з негативним діагнозом метастазування в лімфатичні вузли за звичайною гістологією.
Басейни лімфи з лімфатичними судинами та лімфатичними вузлами, пофарбовані за допомогою нашої техніки ін'єкції синього барвника, також можна класифікувати на п'ять областей: права та ліва шлункові артерії, ліва та права шлунково-яєчна артерія та задня шлункова артерія (Coller et al., 1941). У цьому дослідженні не-СН оцінювали шляхом серійного зрізу та імунозабарвлення, на додаток до звичайних гістологій, а метастатичні не-СН виявляли у двох пацієнтів з метастатичним НС, виявленим за звичайною гістологією, та у одного пацієнта з мікрометастатичним СН, що спостерігався за допомогою RT-PCR і тест Саузерн-блот. Всі ці метастатичні не-SN були розташовані в тому ж лімфатичному басейні, що і метастатичні NS.
Після детального обстеження за допомогою RT-PCR та тесту Саузерна, або послідовного нарізування та імунозабарвлення, всі додаткові метастази в лімфатичні вузли були виявлені в не-СН, розташованих в тому ж лімфатичному басейні, що і раніше виявлені метастатичні. Це означає, що дисекція лімфатичного тазу, що містить НС, є мінімальною вимогою для лікувальної резекції раку шлунка на ранніх стадіях, навіть у пацієнтів без гістологічно виявлених метастазів у НС.