Міметики Smac викликають некротичне запалення та загибель пухлинних клітин шляхом модуляції

предметів

реферат

Макрофаги - це пластичні клітини, які характеризуються різними станами активації. 23 Класично активовані макрофаги (М1) та альтернативно активовані макрофаги (М2) представляють дві крайності у спектрі фенотипу макрофагів.Антерогенези, пов'язані з пухлиною, класифікуються як макрофаги М2 на основі їх профілю експресії цитокінів; Вони виробляють високий рівень імунодепресивних цитокінів, таких як інтерлейкін-10 (IL-10), і, переважно у солідних пухлинах, мають деякі функції відновлення тканин із фібробластами. 23, 25 На відміну від цього, макрофаги M1 продукують велику кількість прозапальних цитокінів, включаючи інтерферон-γ. (IFN & ggr;) та IL-12, і можуть брати участь у спрацьовуванні ефективної протипухлинної імунної відповіді. Пластичність макрофагів запропонувала нові терапевтичні підходи, спрямовані на зміну фенотипу М2 26, особливо при пухлинах, в яких інфільтрація таких макрофагів, як карцинома яєчників, відіграє важливу роль. Відповідно, в моделі асциту яєчників мишей макрофаги генерувались шляхом модуляції NF- & kgr; B сигналізація перепрограмована. 27

Нещодавно ми описали синтез нових димерних молекул, націлених на XIAP, cIAP1 та cIAP2. 28, 29 Одна з цих молекул, SM83, пригнічувала ріст SM-чутливої аденокарциноми молочної залози людини MDA-MB231 та рабдоміосаркоми Kym-1, але не інших клітинних ліній. Тут ми використовуємо дві моделі мишачого ксенотрансплантата ракового асциту, щоб показати, що SM83 при монотерапії збільшує виживання цих мишей, націлюючись на асоційовані з пухлиною макрофаги. За допомогою TNF SM83 швидко індукує некроз внутрішньочеревно (ip) ін’єкційних ракових клітин, які в іншому випадку повністю стійкі in vitro до протипухлинних ефектів SM83. Наша робота показує, що SM83 має різні механізми дії in vitro та in vivo і що він проявляє свою протипухлинну активність in vivo, стимулюючи імунну систему.

Результати

SM83 сенсибілізує клітинну лінію карциноми яєчника IGROV-1 до апоптотичних ефектів TRAIL

SM83 викликає апоптоз in vitro у поєднанні з TRAIL. ( a ) Хімічна структура димерного SM SM83. ( ) Клітинам IGROV-1 давали 0, 1 або 1, 0 мкм M SM83 обробляють окремо або в комбінації з 2 або 10 нг/мл TRAIL. Зростання клітин виражається у відсотках щодо клітин, оброблених фальшивим носієм. Значеннями є середнє значення та SD з експерименту, який є репрезентативним експериментом з трьох проведених експериментів. ( c і d ) Вестерн-блот-аналіз XIAP, cIAP1, cIAP2 та розщепленого PARP (Cl PARP) у клітинах IGROV-1, які обробляли SM83 ( c ) або SM59 (SM-164) ( d ) Лікували за відсутності або присутності 10 нг/мл СЛІДУ. Актин показаний як контроль заряду. Стрілка, конкретна стрічка XIAP

Монотерапія SM збільшує виживання мишей з раковим асцитом

Потім SM83 і SM59 тестували in vivo, використовуючи мишачу модель ксенотрансплантата, в якій клітинам IGROV-1 вводили ip в атимічних оголених мишей, що призводило до асциту та смерті. Лікування як SM83 (2a), так і SM59 (2b) збільшило виживання мишей (P.

Лікування SM83 в монотерапії збільшує виживання мишей з раковим асцитом. ( a ) Оголеним мишам вводили ip клітини IGROV-1 і залишали необробленими (O) або обробляли 5 разів на тиждень протягом 2 тижнів поспіль з дня після ін’єкції 5 мг/кг SM83 (л), 2,5 мг/кг СЛІДУ ( ∇) або з однаковою дозою SM83 і TRAIL разом (▪). Показаний експеримент, що представляє два проведені. Кожна оброблена група містила по сім мишей. Крива виживання для мишей та контрольних груп, які отримували SM83. ( ) Крива виживання для оброблених SM59 і контрольних мишей. Не оброблений (○) або оброблений SM SM59 (∇). ( c Освіта асциту перевіряли шляхом контролю ваги тіла на 17 день. ( d і e ) Клітини Meth A вводили мишам BALB/c і обробляли 5 мг/кг SM83 щодня з 7-го дня. ( d Освіта асциту перевіряли шляхом контролю ваги тіла на 13 день. Горизонтальна лінія представляє середнє значення. ( e ) Крива виживання для необроблених () або оброблених SM83 мишей () з 7-го дня

Щоб перевірити, чи активність in vivo SM83 була специфічною для клітинної лінії чи обмежена для імунодефіцитних мишей, ми використовували іншу модель асциту, в якій клітини саркоми мишачого Meth A вводили ip в імунокомпетентні сингенні миші BALB/c. Подібно клітинам IGROV-1, клітини Meth A не інгібували ріст SM83 in vitro (дані не наведені). У мишей SM83 зменшив прогресування асциту, що вважалося меншим збільшенням маси тіла (2d), і збільшив середній час виживання з необроблених тварин до 26 днів (P = 0,0721; 2e). У цій моделі також поєднання з TRAIL не було вигідним (дані не наведені). Коли мишам, вилікуваним SM83 (4 з 14 випробуваних мишей) вводили нову ін'єкцію 4 × 10 5 клітин Meth A (вдвічі більше, ніж при першому введенні), ніякого нового асциту (дані не показано). Ці результати дозволяють припустити, що у цих тварин виробився адаптивний імунітет.

SM83 швидко вбиває ракові клітини, що плавають в асциті, за допомогою неапоптотичного механізму

Для вивчення механізму активності SM83 in vivo у мишей, яким вводили клітини IGROV-1, збирали рідину асциту та обробляли SM83 протягом 3, 6 або 24 годин, і підраховували пухлинні клітини. Результати показали значне зменшення (П.

Щоб зрозуміти механізм загибелі клітин, відповідальних за зменшення кількості плаваючих пухлинних клітин в асциті, ми дослідили експресію медіаторів апоптозу в цих клітинах у різні моменти часу. Через 24 години лікування SM83 привело лише до незначного збільшення розщепленого PARP, відсутність свідчень розщепленої активної каспази-8 (що очікувалося, оскільки ці клітини вбиваються монотерапією SM in vivo) і лише незначний ефект на розщепленні каспази -3 (малюнок 3d). На відміну від них, клітини, оброблені TRAIL, демонстрували більшу активацію цих апоптотичних маркерів, хоча TRAIL був неефективним у зменшенні кількості клітин асциту (додаткова фігура S1). Намагаючись виявити апоптотичні події, вестерн-блот проводили на клітинах, зібраних через 3 і 6 годин лікування (3е). І в цьому випадку SM83 спричинив повну деградацію cIAP1 та cIAP2, але спостерігалося лише слабке накопичення розщеплених форм PARP, каспази-8 та каспази-3. Ця низька активація апоптотичного каскаду вказувала на те, що причина смерті клітин пухлини асциту не була в першу чергу апоптотичною.

Щоб оцінити можливість того, що аутофагія - ще один механізм, який може призвести до загибелі клітин при аномальній та постійній активації - відповідає за втрату асциту пухлинними клітинами, ми виміряли рівні Бекліна-1 та розщепили LC3B. Лікування SM83 не підвищувало рівні цих білків (додатковий малюнок S2), що свідчить про те, що аутофагія не бере участі в індукованій SM83 загибелі клітин пухлини.

SM83 викликає запальну подію in vivo

Лікування SM83 викликає експресію запальних цитокінів in vivo. Оголеним мишам вводили ip клітини IGROV-1 і обробляли разову дозу 5 мг/кг SM83 чи ні; Асцит збирали через 3, 6 та 24 години після введення SM83. ( a ) SM83 тимчасово підвищував рівень TNF у миші, виміряний методом ІФА. ( ) Обробка SM83 зменшила кількість клітин асциту, але цей ефект був заблокований, коли TNF секвестрували з використанням більшої дози етанерцепту (P = 0,0118 порівняно з лікуванням лише SM83). ( c ) Вестерн-блот білка клітини пухлини асциту від необроблених мишей та мишей, які отримували SM83 окремо або в комбінації з 150 мг/кг етанерцепту. Стрілка, конкретна стрічка для XIAP. ( d - H ) Результати ІФА для IL-1? ( d ), ІФН-? ( e ), Іл-10 ( f ), трансформуючий фактор росту & bgr; (TGF-?) ( G ) та ІЛ-4 ( H ) в асцитній рідині мишей, оброблених, як зазначено вище. Результати для IL-10 показані у вигляді складчастої індукції через відсутність рекомбінантного білкового стандарту

SM83 сприяє активації макрофагів у напрямку до M1-подібного фенотипу

Лікування СМ активує макрофаги та сенсибілізує їх до некротичної смерті. ( a і ) BALB/c BMDM (5 × 105) висівали в 96-лункові планшети, давали прилипати протягом 16 год і вводили 1. M SM83 оброблений чи ні. Лікування SM83 сприяло секреції прозапальних цитокінів TNF ( a ) та IL-1β ( ). ( c ) NF-? Активація B за допомогою SM83, оцінена в клітинній лінії макрофагів RAW, стабільно трансфікованій NF-? Репортерний ген В-люциферази. Показаний репрезентативний експеримент із двох проведених. Значення - середнє та SD; n = 3. ( d і e ) BALB/c BMDM висівали в шість лункових планшетів, давали прилипати протягом 16 годин і обробляли серійними розведеннями SM83 у відсутність або присутність некростатину-1 або z-vad-fmk для інгібування некроптозу або апоптозу відповідно. ( г) Репрезентативні зображення, що демонструють морфологію клітин після 24 годин лікування. ( e ) Життєздатність клітин після лікування, оціненого за допомогою аналізу CellTiter-Glo

Щоб виключити можливість того, що індукований SM83 ІЛ-1? Секреція відбувається через забруднення ліпополісахаридами (LPS), ми підготували BMDM від нокаутованих мишей TLR4 і виявили, що IL-1? секретувався у такій же мірі, як і з клітин BALB/c (додаткова фігура S4). Крім того, було встановлено, що препарати для ін’єкцій SM83 не містять виявлених кількостей LPS у тесті Endosafe PTS (Charles River Laboratories, Calco, Італія) (дані не наведені). Ці результати вказують на те, що індукований SM83 IL-1? -Виробництво не відбулося через забруднення ЛПС.

Накопичення нейтрофілів сторонніми спостерігачами в асциті

Потім нейтрофіли виділяли з селезінки мишей із вмістом BALB/c (дикий тип) та дефіцитом рецептора 1 до TNF (TNF-R1), щоб дослідити роль нейтрофілів у протипухлинній активності SM83 in vitro. У аналізах Трансвелла міграція нейтрофілів дикого типу до асциту від мишей, оброблених SM83, була більшою, ніж від необроблених мишей (6d). Інгібітор HMGB-1 частково зменшив міграцію, тоді як нейтрофіли мишей з дефіцитом TNF-R1 не мігрували у відповідь на асцит мишей, оброблених SM83. Асцит мишей, які отримували активовані SM83 нейтрофіли дикого типу з утворенням супероксиду навіть у присутності блокатору TNF етанерцепту, тоді як гліциризин повністю блокував цю активність (6е). Ці результати дозволяють припустити, що міграція нейтрофілів у присутності асциту від мишей, оброблених SM83, стимулюється TNF, тоді як активація відбувається завдяки HMGB-1. Важливість TNF для міграції нейтрофілів також була продемонстрована in vivo, де попередня обробка етанерцептом заблокувала набір цих клітин в асцит (додатковий малюнок S5).

Підсумовуючи, наша робота показує, що SM83 діє in vivo при раковому асциті, повертаючи макрофаги з М2-подібного фенотипу, що підтримує пухлину, до М1-подібного фенотипу, який наділений протипухлинною активністю. Макрофаги M1 секретують цитокіни, такі як TNF, IL-1? та ІФН? спричинення швидкої TNF-залежної некротичної смерті ракових клітин асциту (7); Потім відмираючі клітини вивільняють HMGB-1, який разом з TNF стимулює масивну інфільтрацію нейтрофілів.

Запропонований механізм дії SM83 при раковому асциті. SM83 стимулює зворотний перехід макрофагів з фенотипу M2 у фенотип M1. ФНО, що виділяється макрофагами M1, викликає некротичну загибель ракових клітин в асцитній рідині; Вмираючі клітини вивільняють HMGB-1, який разом з TNF вербує нейтрофіли

обговорення

У цьому дослідженні ми описуємо активність in vivo нещодавно синтезованого SM SM83 у двох моделях ксенотрансплантата при раковому асциті у мишей. Ми показуємо, що SM83 ефективний як монотерапія in vivo на ракових клітинах людини та мишей, стійких до SM in vitro, і показуємо, що ці клітини гинуть за неапоптотичним, залежним від TNF механізмом. Ми також надаємо докази того, що SM83 здійснює свою діяльність, викликаючи запалення та активацію імунних клітин, що призводить до імуногенної смерті ракових клітин. Крім того, наше дослідження показує, що активність SM83 (і, можливо, інших SM) в комплексі в середовищі in vivo відрізняється від тієї, що вже спостерігалася in vitro.

В мікросередовищі пухлини, включаючи рак яєчників, макрофаги набувають М2-подібний фенотип. 38, 39 Тим не менше, деякі автори пропонують різні стратегії 23, 24, які можуть обмінюватися статусом макрофагів у напрямку ефективної протипухлинної відповіді. У цьому контексті також була показана можливість підвищення ефективності стандартних методів терапії, які порушують макрофаги М2, 40 особливо при пухлинах, прогресування яких суто залежить від їх підтримки, наприклад, карциноми яєчників. Ці пухлини створюють складні взаємозв'язки з асоційованими імунними клітинами в асциті 41 і розвивають імунодепресивне мікросередовище, продуковане макрофагами. Тому при раку яєчників реполяризація макрофагів або гальмування їх вербування може бути новою ефективною терапевтичною стратегією.

Наші результати показують, що СМ регулюють імунну відповідь на раковий асцит шляхом поляризації макрофагів і, таким чином, мають терапевтичний потенціал. Фактично, Smac/DIABLO 42 та міметичний SM83, показаний тут, викликають некротичну або некротичну загибель клітин. Некротичні клітини, крім апоптотичних, вивільняють неокислену, імуногенну форму аларміну HMGB-1 43, яка активує дендритні клітини, активуючи рецептори просунутих кінцевих продуктів глікування, рецептори TLR4, TLR7 і TLR9. 44 Крім того, некротичні клітини можуть тренувати CD4 + Т-клітини, які є важливими для розвитку адаптивної імунної відповіді. 45 Можливість того, що адаптаційну імунну відповідь спричиняє індукований SM83 некроз, підвищується нашими результатами при використанні імунокомпетентних мишей BALB/c з асцитом мет-А. Деякі з цих мишей були вилікувані обробкою SM83 і не розвинули подальшого асциту під впливом нової подвійної дози клітин Meth A, що припускає, що вони були імунітетом до клітин саркоми Meth A.

Таким чином, наші дані показують, що SM83 активний у монотерапії, сприяючи запаленню та імуногенній загибелі клітин. Ці спостереження дають пояснення, чому СМ підвищує ефективність стандартної терапії, стимулюючи імунну систему. Нарешті, докази того, що SM може викликати запальну реакцію та активізує імунну систему, дають інтерпретацію того, чому SM може бути ефективнішим in vivo, ніж in vitro, 11, 46, і наші результати вбивства ракових клітин.