Місцева проліферація призводить до накопичення макрофагів у жировій тканині при ожирінні

предметів

реферат

Накопичення макрофагів жирової тканини (АТМ) є важливою особливістю хронічного запалення, пов’язаного з ожирінням. Це також важливо для регулювання розвитку ожиріння. У худих тварин є невелика кількість резидентних клітин АТМ, розподілених серед адипоцитів, які вважаються макрофагами М2. У разі ожиріння в жировій тканині накопичуються значно збільшені макрофаги і утворюють так звану "коронкоподібну структуру" (CLS) навколо мертвих адипоцитів. 1, 2 Ці макрофаги мають фенотип M1 і продукують різні типи запальних цитокінів, такі як TNF- & agr; що призводить до поширення запалення внаслідок ожиріння та розвитку метаболічних порушень, таких як резистентність до інсуліну. 3, 4, 5

Традиційно накопичені банкомати розглядаються як результат міграції периферичних моноцитів в умовах запалення. Останнім часом все більше доказів показують, що підтримка тканинних макрофагів, ймовірно, не залежить від поповнення циркулюючих моноцитів і навіть не залежить від попередників кісткового мозку. 6 Насправді різні типи тканинних макрофагів здатні оновлюватися і розмножуватися локально в наївному стані, такі як мікроглія, 7, 8, Купффер, 9 та клітини Лангерганса. У гострому запальному стані, наприклад під час паразитарної інфекції, посилюється локальна проліферація макрофагів, і ці макрофаги виявляють фенотипи альтернативно активованих макрофагів - процес, який контролюється цитокінами Th2. 11 При хронічних запальних станах, таких як артеріосклероз, спостерігається також місцева проліферація макрофагів, що сприяє накопиченню макрофагів в артеріальних стінках. 12 Нещодавно повідомлялося, що локальне розмноження макрофагів може сприяти накопиченню ожиріння в банкоматах. 13, 14

Результати

Накопичення банкоматів на ранніх стадіях ожиріння пов’язане з поширенням макрофагів

призводить

Накопичення макрофагів у жировій тканині пов’язане з проліферацією in situ на ранніх стадіях ожиріння. ( a ) Вага тіла мишей, яких годували ND та HFD (n = 10 мишей у кожній групі). Смужки помилок представляють середні значення ± SEM *** P + банкомати в eAT від мишей на ND або HFD. Шкала шкали, 100 мкм

Рання стадія генетичного ожиріння пов’язана з розповсюдженням банкоматів

Ожиріння є результатом складної взаємодії ген-середовище. У моделі генетично успадкованого ожиріння мишей з дефіцитом рецептора лептину (мишей прокази db/db, які зазвичай називають db/db), ми досліджували не тільки ожиріння, пов'язане з дієтою, але й те, чи можна розмножувати макрофаги in situ на Бере участь накопичення. db мишей). Ми виявили, що накопичення ATM у жировій тканині (eAT та iAT) мишей прокази db/db на ранніх стадіях ожиріння (7 тижнів) різко зростає порівняно з їх гетерозиготними послідами (2a). Тим часом макрофаги Ki67 + значно збільшились у жировій тканині 7-тижневих мишей прокази db/db (2b). Ми також провели тест на включення EdU і виявили, що на ранніх стадіях генетичного ожиріння (віком 10 тижнів) у жировій тканині мишей db/db прокази спостерігалося значно більше включених EdU макрофагів (малюнки 2c і d). Відсоток включених в EdU банкоматів від мишей з розвиненим генетичним ожирінням (30 тижнів) також був значно вищим, ніж у худих одноколесників. Таким чином, проліферація макрофагів сприяє накопиченню ATM при генетичному ожирінні.

накопичення

проліферація

Для порівняння ми додатково проаналізували химерний рівень еозинофілів у жировій тканині. Еозинофіли - це ще одна підгрупа мієлоїдних клітин, які, як було показано, мігрують з периферичної крові в жирову тканину і відіграють важливу роль у підтримці гомеостазу глюкози, 15 які не розмножуються у ожирілих або худих мишей (додаткові рисунки S1a та b ). . На відміну від банкоматів, очевидні донорські (CD45.1 +) еозинофіли спостерігали в жировій тканині мишей із ожирінням як на ранніх стадіях (8-тижневий HFD), так і на пізній стадії ожиріння (12-тижневий HFD) (рисунок 3d)). З цієї причини ми підтвердили, що накопичення АТМ спричинене проліферацією резидентних макрофагів на ранній стадії ожиріння та сприяє подальшій міграції моноцитів на пізній стадії ожиріння.

Ми також порушили цікаве питання: чи сила макрофагів розмножуватися обмежена вітчизняними банкоматами, чи це також може спостерігатися у набраних макрофагів? Щоб виправити це, ми провели тест на включення EdU на химерних мишах, що харчуються HFD, протягом 12 тижнів. Цікаво, що в жировій тканині були виявлені як включені в CDM банкомати CD45.2 + та CD45.1 + -Edu (рис. 3е), що вказує на те, що макрофаги розмножуються незалежно від їх походження. Таким чином, локальне розмноження як резидентних, так і рекрутованих макрофагів сприяє накопиченню банкоматів.

CCL2 непотрібний для накопичення макрофагів на ранніх стадіях ожиріння

На підтвердження висновку, що проліферація, а не міграція моноцитів, відіграє вирішальну роль у накопиченні ATM при ранньому ожирінні, ми проаналізували місцеву експресію CCL2 (MCP-1) в жировій тканині, яка є центральним хемоаттрактантом для міграції моноцитів є. Цікаво, що при внутрішньоклітинному фарбуванні ми виявили, що CCL2 в основному експресується CD45 - CD31 - стромальними клітинами в жировій тканині, а не CD45 + лейкоцитами або CD31 + ендотеліальними клітинами. Дійсно, ні в одній з трьох популяцій клітин, отриманих із жирової тканини ожирених мишей, не спостерігалося збільшення експресії CCL2 порівняно з нежирними мишами (рис. 4а). Отже, рівень CCL2 у сироватці крові не змінювався на ранніх стадіях ожиріння (рис. 4b). Однак на пізній стадії ожиріння (HFD> 12 тижнів) у сироватці крові було виявлено значно вищий рівень CCL2 (рис. 4в). Ці результати показують, що індукована CCL2 міграція моноцитів не є визначальним фактором накопичення ATM на ранній стадії ожиріння, тоді як вона може регулювати накопичення ATM на відносно пізнішій стадії ожиріння.

накопичення

призводить

Банкомати, що розповсюджуються, бажано розташовувати в CLS. ( a ) Імунофлуоресценція, що показує локалізацію Ki67 + банкоматів у індукованих HFD мишей із ожирінням. Стрілки позначають банкомати за межами CLS. Шкала шкали, 100 мкм. ( ) Відсоток банкоматів Ki67 + у CLS та поза CLS, де 225 банкоматів було об'єднано з 7 зображень імунофлюоресценції. *** Р + банкомати поступово зменшувались разом із прогресуванням ожиріння. Детальний аналіз показав, що експресія RELM- & agr; в банкоматах Ki67 + набагато нижчий у порівнянні з банкоматами Ki67 (додатковий малюнок S2). TNF-? + Банкомати спочатку збільшували, а потім зменшували в міру розвитку ожиріння. Відсоток Ki67 + TNF- & agr; + Банкомат порівнянний з банкоматом Ki67 - TNF- & agr; + Банкомати (додатковий малюнок S3).

Сигналізація IL-4/STAT6 є головним фактором розповсюдження банкоматів

Далі ми досліджували мітогенні стимули для розповсюдження ATM. Було показано, що IL-4, 11 M-CSF, 12 і CCL2 13 можуть контролювати місцеву проліферацію макрофагів. Однак, коли ми вивчали вплив цих цитокінів на проліферацію АТМ, ми виявили, що лише введення IL-4 може збільшити проліферацію АТМ у худих мишей. 19 Коли IL-4 вводили внутрішньоочеревинно худим мишам, спостерігалося різке збільшення AT67 Ki67 + (рис. 6а). Після зв’язування з рецептором IL-4 активує JAK1 та JAK3, а потім призводить до фосфорилювання STAT6, центрального фактора транскрипції біологічних реакцій, опосередкованих IL-4. 20 Ми виявили, що індукована IL-4 проліферація банкоматів у мишей з дефіцитом STAT6 була сильно порушена (рис. 6а), що свідчить про критичну роль сигналізації IL-4/STAT6 в ATM, керованому IL-4 - вказує на розповсюдження. Що ще більш важливо, у мишей з HFD відсоток Ki67 + банкоматів у мишей з дефіцитом STAT6 був значно нижчим, ніж у мишей WT (6b). Таким чином, сигналізація IL-4/STAT6 є рушійною силою розповсюдження банкоматів при ожирінні.

призводить

IL-4/STAT6 керує розповсюдженням банкоматів. ( a ) Експресія Ki67 в банкоматах від eAT мишей WT та STAT6 -/-, які піддавалися дії комплексу антитіл IL-4 та IL-4 (для продовження біодоступності IL-4 in vivo) або PBS протягом 48 годин лікувалися. ( ) Експресія Ki67 мишей WT та STAT6 -/- на HFD у банкоматах (n = 10 у кожній групі). Наведено середні значення ± SEM

обговорення

Ожиріння пов’язане з накопиченням банкоматів, які поширюють хронічне запалення та сприяють резистентності до інсуліну. Попередні звіти показали, що міграція моноцитів крові сприяє проникненню макрофагів у місця запалення. 1, 16, 21 Останні дані свідчать про те, що місцеве розповсюдження також відіграє певну роль у регулюванні накопичення банкоматів у людей із ожирінням. 13, 14 Однак відповідний внесок цих двох подій у накопичення банкоматів під час прогресування ожиріння не розглядався. У цьому дослідженні ми показали, що проліферація резидентних макрофагів in situ визначає накопичення ATM на ранній стадії ожиріння, тоді як іммігрантські моноцити сприяють накопиченню ATM на відносно пізній стадії ожиріння. Крім того, як резидентні, так і рекрутовані макрофаги розмножуються в жировій тканині ожирілих мишей (узагальнено в 7).

проліферація

Схематичне зображення внеску проліферації макрофагів та вербування моноцитів у накопичення ATM при ожирінні. У худих мишей макрофаги-резиденти перебувають у стані спокою в жировій тканині і підтримують базовий рівень клітинності шляхом самообновлення. На ранніх стадіях ожиріння ці резидентні макрофаги розмножуються і призводять до накопичення ATM, яке контролюється подразниками, що виділяються адипоцитами та/або іншими імунними клітинами. На пізній стадії ожиріння накопичення АТМ додатково збільшується за рахунок похідних моноцитів макрофагів, які також мають здатність до проліферації. Ці проліферуючі макрофаги завжди локалізуються в CLS і оточують апоптотичні адипоцити. Червоні ядра свідчать про те, що макрофаги розмножуються

Раніше повідомлялося, що периферична інфільтрація моноцитів відіграє важливу роль у накопиченні ожиріння в банкоматах. 1 В якості одного з основних хемокінів при опосередкуванні вербування моноцитів, було висловлено припущення, що CCL2 (MCP-1) опосередковує накопичення ATM при ожирінні. 16 Однак інший звіт показує, що за відсутності CCL2 не спостерігалося зменшення накопичення макрофагів у жировій тканині. 22 Ці суперечливі результати свідчать про те, що міграція моноцитів - не єдиний спосіб регулювання накопичення макрофагів у жировій тканині під час розвитку ожиріння.

Наші результати показують, що резидентні макрофаги накопичуються в жировій тканині мишей під час худої та ранньої фаз ожиріння. Аналіз фенотипу банкоматів під час прогресування ожиріння показав, що значна кількість альтернативно активованих макрофагів присутня під час худої та ранньої фаз ожиріння. Однак на пізній стадії ожиріння цей тип макрофагів різко зменшується. Цікаво, що повідомлялося, що активовані альтернативно макрофаги збільшують здатність ліпідного катаболізму. 24, 25, 26 Тому альтернативно активовані макрофаги на ранніх стадіях ожиріння є основною резидентною популяцією макрофагів з більш спеціалізованим ліпідним катаболізмом, ніж іммігрантські макрофаги.

Підводячи підсумок, нам вдалося встановити, що накопичення макрофагів у жировій тканині під час ожиріння спричиняється проліферацією in-situ резидентних банкоматів та сприяє узгодженій активації міграції моноцитів та проліферації макрофагів. Наші спостереження дають уявлення про еволюцію запалення, пов’язаного з ожирінням, і можуть послужити керівництвом для розробки терапевтичних стратегій для розладів, пов’язаних із ожирінням.

Матеріали та методи

Випробування на тваринах

Мишей C57BL/6 було придбано у Шанхайському лабораторному центрі тварин Китайської академії наук (Шанхай, Китай). Мишей CD45.1 на фоні C57BL/6 люб’язно надав Dr. Янюн Чжан з Інституту наук про здоров’я Академії наук Китаю. Гетерозиготні миші з дефіцитом рецепторів лептину (Lepr db/+) на фоні C57BL/6 були придбані в Модельному дослідницькому центрі тварин Нанкінського університету (Нанкін, Китай) і виведені в нашій лабораторії. Миші STAT6 -/- (C.129S2-Stat6 tm1Gru/J) були з лабораторії Джексона (Бар-Харбор, штат Мен, США). Усі експерименти були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Інституту наук про здоров'я Шанхайського інституту біологічних наук Китайської академії наук.

Дієтичне ожиріння проводили шляхом годування 5-тижневих мишей HFD, що містять 60 ккал% жиру (D12492, Research Diets, Нью-Брансвік, Нью-Джерсі, США). Контрольну групу годували ND. Тест на включення EdU проводили за допомогою тестових наборів Click-iT-EdU (Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія, США) відповідно до інструкцій виробника. Мишам давали 10 мкм за 3 години до забиття. g EdU/г маси тіла, що вводиться ip. Реакцію Click-iT проводили на жировій тканині та аналізували за допомогою проточної цитометрії та імуногістології. Щоб визначити внесок резидентних макрофагів у накопичення банкоматів, нижню частину живота знеболених мишей CD45.2 екранували свинцевим блоком товщиною 6 см. Цим мишам давали дозу опромінення 9,5 Гр & ggr; опромінювали та вводили в/в 10 7 клітин кісткового мозку CD45.1. Химерних мишей залишали для відновлення на 7 тижнів до лікування дієтою. Для вивчення ролі IL-4 у проліферації АТМ кожній миші давали комбінацію 5 мкг. g IL-4 (Peprotech, Роккі Хілл, Нью-Джерсі, США) та 25 мкг. g антитіло до IL-4 (клон 11B11, Harlan) ip, що вводять біопродукти для Science, штат Індіанаполіс, США, або аналіз PBS та ATM проводили через 48 годин.

Проточна цитометрія

EAT і iAT збирали у жертвопринесених мишей, розрізали на невеликі шматочки і промивали PBS протягом 1,5 годин 2 мг/мл колагенази I (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) перед перетравленням. Плаваючі адипоцити відокремлювали центрифугуванням суспензії клітин при 600 × g протягом 10 хвилин. Піддони ресуспендували, фільтрували через сита 70 мкм і лізували еритроцити. Суспензію клітин попередньо інкубували з анти-CD16/CD32 (eBioscience, Сан-Дієго, Каліфорнія, США), щоб блокувати рецептори Fc перед фарбуванням поверхневої молекули. Внутрішньоклітинне фарбування проводили за допомогою наборів для фіксації та проникнення відповідно до інструкцій виробника (eBioscience). Моноклональні антитіла щурів, включаючи F4/80, CD45, CD11b, CD45.1, CD45.2, Ki67 та TNF-α, були від eBioscience; CD115 та Siglec-F були від Biolegend (Сан-Дієго, Каліфорнія, США).

Для внутрішньоклітинного фарбування RELM- & agr; і TNF-? 1: 1000 GolgiPlug (BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія, США) був доданий до колагенази під час перетравлення тканин в банкоматах. Після фарбування поверхневої молекули проводили внутрішньоклітинне фарбування за допомогою набору для фіксації та набору для пермеабілізації відповідно до інструкцій виробника (eBioscience). Використовували кролячий анти-RELM-α (Abcam, Кембридж, Массачусетс, США) та кон’югований козячий анти-кролячий IgG Alexa Fluor 488 (Life Technologies).

Імуногістохімія

Жирову тканину розрізали на дрібні шматочки і закріпили 4% параформальдегідом протягом 24 годин при 4 ° С. Потім було проведено повне фарбування. Коротко кажучи, зразки проникли 1% Triton X-100, блокували 1% BSA та 3% FBS у PBS, а потім інкубували з відповідними антитілами до молекул поверхні або серцевини. У деяких експериментах адипоцити були забарвлені BODIPY 558/568 C12 (Invitrogen).

Статистичний аналіз

Дані представлені як середнє значення ± SEM, а значимість оцінювали неспареним двостороннім t-тестом, якщо не зазначено інше. Ми розглянули P ATM