Модель апендектомії миші хронічного коліту, асоційованого з колоректальним раком за допомогою точної локалізації

Резюме

Представлений протокол описує просте хірургічне видалення червоподібного відростка (цекальної ділянки) у миші з наступною індукцією раку товстої кишки, пов’язаного із запальним захворюванням кишечника. Ця модель мишейної апендектомії дозволяє дослідити біологічну роль апендикса в патогенезі шлунково-кишкових захворювань людини.

Анотація

Вступ

Клінічна апендектомія - це стандартна хірургічна процедура з видаленням апендикса, головним чином через запалення (наприклад, апендицит) 1, 2, 3. Однак біологічна функція червоподібного відростка людини залишається суперечливою 4, 5, 6. Додаток вважався залишковим залишком, що викинувся із сліпої кишки у товсту кишку. Донедавна еволюційні, імунологічні, морфологічні та мікробіологічні дослідження вказували на те, що апендикс може виконувати різні функції. Ці ролі включають вироблення імуноглобінів (наприклад, IgA та IgG), різноманітних В-клітин і Т-клітин, які є критично важливими для адаптивних імунних відповідей в асоційованих з кишечником лімфоїдних тканинах (GALT), та поповнення товстої кишки з коменсальною мікробіотою. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 .

Клінічні епідеміологічні дослідження пацієнтів з попередньою апендектомією або гострим апендицитом також відіграють свою потенційну роль у патогенезі захворювань людини, таких як запальні захворювання кишечника (ВЗК), рак товстої кишки та нешлунково-кишкові захворювання (наприклад, хвороба Паркінсона та серцево-судинна система) 13, 14, 15, 16, 17, 18. Наприклад, велике когортне дослідження азіатської популяції з 75 979 хворих на апендектомію нещодавно продемонструвало значну зв'язок між раком апендекта та смертністю 14, 19. Відповідно, створення відповідної моделі апендектомії тварин, яка нагадує людину, буде корисним при вивченні біологічних функцій та молекулярних механізмів апендикса в патогенезі захворювання.

У багатьох ссавців є апендикс або орган, схожий на апендикс, включаючи приматів, лагоморфів (наприклад, кроликів), деяких гризунів та сумчастих тварин 20. У маленьких і часто використовуваних лабораторних тварин у кролика є червоподібний відросток, який схожий на людський 21, 22, але GALT у кроликів надзвичайно великий у порівнянні з людьми, оскільки більшість лімфатичних тканин також знаходяться в ділянках Пейєра, які є обома тонкими - а також у товстій кишці 21. Крім того, кролик демонструє іншу лімфоїдну фолікулярну структуру, розподіл Т-клітин та щільність імуноглобуліну у людей, що робить їх придатки непридатними для дослідження 21 .

Миші - це найбільш широко використовувана тваринна модель для вивчення патофізіології людини та тестування різних існуючих та нових терапевтичних засобів 23, 24, 25. Вважається, що єдине біле велике лімфоїдне скупчення на кінчику сліпої кишки у мишей, відоме як цекальна ділянка, виконує функції, подібні до функцій людського додатка 26, 27, 28. Однак відокремити ділянку сліпої кишки від сліпої кишки у мишей практично важко. На сьогоднішній день звичайні хірургічні процедури для індукції апендициту на моделі миші передбачають порівняно великий розріз (наприклад, 1-2 см) крізь черевну стінку, щоб отримати доступ до всієї сліпої кишки (Додаткова таблиця 1) 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 .

У цьому документі, щоб сформувати модель апендектомії, пов’язану із захворюваннями шлунково-кишкового тракту, у цьому звіті представлений легкий хірургічний протокол для зняття гіпсових робіт у слідої кишки у мишей. Далі слідує комбіноване введення генотоксичного агента AOM та прозапального агента DSS для індукції асоційованого з колітом раку товстої кишки, подібного до такого у людей. Показано, що ВЗК є фактором ризику раку товстої кишки 37, 38. Поєднання AOM/DSS-індукованого хронічного коліту, асоційованого раку товстої кишки, добре відоме, і читачі можуть посилатися на Neufert et al. та Тейкер та ін. детальніші процедури див. на 39, 40. Ця відтворювана і швидка модель мишачої апендектомії може бути використана для вивчення модульованого відростком запалення кишечника та мікробіоти товстої кишки, особливо при розвитку та прогресуванні ВЗК та раку товстої кишки.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Усі практики з тваринами схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Університету Сіань Цзяотун (No.XJTULAC2019-1023).

2. Індукція хронічного коліту-асоційованого раку товстої кишки з AOM та DSS

ПРИМІТКА. Виконайте цю процедуру через 7 днів після апендектомії.

3. Оцінка запалення кишечника та пухлини (70 днів після введення АОМ)

  1. Пожертвуйте мишами, вдихаючи СО2 із швидкістю заповнення 10% у камері евтаназії з подальшим вивихом шийки матки.
  2. Збирають всю товсту кишку від вершини клубово-кишкового з’єднання до заднього проходу.
  3. Оголіть просвіт, відкривши вздовж ободової кишки. Розріжте всю товсту кишку на шматки довжиною 10 см і зафіксуйте тканину товстої кишки у 10% формаліні на 72 год для фарбування гематоксиліном та еозином (H&E).

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Встановлення моделі мишачої апендектомії

Цю модель мишачої апендектомії при хронічному коліті, асоційованому раку товстої кишки, можна створити, дотримуючись послідовних хірургічних та індукційних етапів, як показано на малюнку 1показано. Найпоширеніші положення сліпої кишки в лівій і правій клубовій ямці, за якою слідує середня лінія живота (рис.2)). Швидкість попередньої локалізації сліпої кишки перед розрізом живота методом пальпації становить майже 70% (Додаткова інформація, таблиця S2). Процедури апендектомії, по суті, складаються з шести важливих етапів (рисунок 3). Під час апендектомії виріз середньої лінії довжиною до 0,5–1,0 см є критичним для мінімізації хірургічної травми (Рисунок 3А.). У разі внутрішньоочеревинного витоку необхідні перев'язувальні мезангіальні судини та закриття кукси сліпої кишки з накладними швами замість простого перев'язування (Рисунок 3B, C, D, E).

Оцінка IgA як біомаркера у мишей з апендектомією

Для підтвердження мікотомії червоподібного відростка після операції збирали товстий кишечник мишей та вміст калу для визначення концентрацій IgA-специфічних плазматичних клітин та секреторних концентрацій IgA (sIgA). Миші з апендектомією продемонстрували значне зниження відсотка В220-IgA + специфічних плазматичних клітин порівняно з підробленою групою (Рисунок 4ВІД). Крім того, підроблені миші підтримували концентрацію SIgA у фекаліях протягом 14 днів після операції порівняно із власним початковим станом до операції, тоді як група апендектомії показала значне зниження рівня SLgA на 14 день (Рисунок 4C.).

Валідація асоційованого з колітом раку товстої кишки у мишей на апендиксі

Порівняно з 3% DSS, у яких більшість мишей групи апендектомії демонстрували важкі ускладнення та значну втрату ваги (Малюнок 5А.), 2% DSS у поєднанні з AOM забезпечували 80% виживання як у фіктивних, так і в апендектомічних групах, адекватні зміни маси тіла (Рисунок 5E.). В кінці трьох циклів лікування товсту кишку збирали для патологічної оцінки. Візуальний огляд та фарбування H&E показали пухлини товстої кишки із запаленням товстої кишки та різним ступенем аденокарцином (добре, помірно та низькодиференційованих аденокарцином) у мишей, які отримували 2% AOM/DSS (Рисунок 6).

миші
Рисунок 1: Схематичне зображення створення моделі мишачої апендектомії при хронічному коліті, асоційованому раку товстої кишки.
(А.) Блок-схема основних хірургічних етапів (перші три є критичними) при апендектомії. (B.Індукція раку товстої кишки. Через сім днів після операції на апендиксі одночасно вводили AOM і DSS. Ваги миші реєстрували в різний час (червоний трикутник). На 70 день після операції мишей забивали і кишкову тканину збирали для подальшого дослідження. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

хронічного
Рисунок 2: Попереднє визначення положення плями сліпої кишки у мишей перед розрізом живота.
(А.) Підсумок ймовірності знаходження позиції сліпої кишки. Анатомічні зображення трьох найпоширеніших положень сліпої кишки на (B.) внизу праворуч, (C.) Середній та (Д.) нижній лівий живіт миші. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

апендектомії
Рисунок 3: Критичні етапи в мишачій апендиксектомії.
(А.) Невеликий розріз, розміщений 0,5-1,0 см; (B.) Витягніть точну частину плями сліпої кишки після попереднього складання сліпої кишки. (C.) Перев'язка брижових судин, що супроводжують сліпу кишку. (Д.) Позначення місця зрізу сліпої кишки швом 4-0. (E.) Закрийте пень ходовими швами швом 8-0. (Ф.) Закриття м’язового шару перерваними швами швом 8-0. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

модель
Малюнок 4: Кількісне визначення IgA-специфічних плазматичних клітин та концентрації SIgA в калі після апендектомії.
(А.) Репрезентативні точкові графіки для клітин, забарвлених анти-IgA та B220 по всій товстій кишці підставних та апендектомічних мишей через 1 день та 14 днів після операції. Лімфоцити у власній пластинці свіжо готували та фарбували FITC проти мишачого IgA, PE антимиша CD45R/B220 для проточної цитометрії. Цифри в діаграмах означають відсоток клітин у відповідних областях. (B.) Кількісне визначення IgA-специфічних плазматичних клітин у фіктивних та апендектомічних групах. Дані представляють середнє значення sD; n = 5-8 мишей; * p Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Модель миші на апендектомію асоційованого з колітом раку товстої кишки була отримана хірургічними етапами з високим рівнем виживання у мишей. У більшості випадків було важко передбачити його положення без лапаротомії, оскільки сліпа кишка розташована під черевною стінкою(Додаткова таблиця 1, додаткова таблиця 2та малюнок 2), оскільки важко було передбачити його положення без лапаротомії. У цьому хірургічному протоколі було введено простий крок до дотику до шишки, а кількісна оцінка розташування сліпої кишки була також надана як керівництво для підвищення точності попередньої локалізації сліпої кишки (Рисунок 2). Використання анатомічних характеристик для видалення сліпої кишки мінімізувало порушення роботи ненавмисних відділів кишечника, тим самим зменшуючи частоту можливих ускладнень апендициту та інфекції черевної порожнини.

У цій моделі передбачено три важливі кроки. По-перше, візуальний огляд та пальпація перед лапаротомією можуть бути корисними для визначення загального розташування сліпої кишки. Незважаючи на те, що сліпа кишка найімовірніше знаходиться в лівій клубовій ділянці живота, ділянка сліпої кишки, що виступає з кінчика сліпої кишки, часто є дисоціативним (тобто рухається або пташиним) і, швидше за все, виявляється під середньою очеревиною (Малюнок 2). По-друге, бажаний невеликий розріз на середній лінії живота та точне оголення ділянки сліпої кишки. Це пов’язано з тим, що на середній лінії живота є тонка пляма, де врізання в таке положення може зменшити можливу травму м’язового шару живота. Щоб уникнути вульви при апендициті, що шкодить мишам, точне опромінення сліпої кишки мінімізує ненавмисне порушення роботи кишечника та зменшує ризик виникнення вульви. Крім того, мінімальний вплив на черевну порожнину може забезпечити, щоб кишечник залишався необтяженим, теплим і вологим; В іншому випадку надмірне опромінення може призвести до значних втрат тепла та висихання тканин 41 .

По-третє, дезінфекція та закриття кукси сліпої кишки за допомогою запущених швів замість простого перев’язування необхідні для запобігання можливих кровотеч та дезінфекції вмісту сліпої кишки кукси. Рівні IgA-специфічних плазматичних клітин та фекалій у товстому кишечнику мишей значно знижуються за рахунок апендектомії, що свідчить про те, що пляма сліпої кишки є основним місцем утворення IgA, принаймні на початковій фазі 33. У товстому кишечнику sIgA діє як захисник здоров'я слизової оболонки, стабілізуючи нормальну колонізацію рослинної флори та протидіючи патогенним мікробам 42. Видалення апендикса зменшує вироблення IgA і може порушити залишок слизової.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.