Модель атеросклеротичної бляшки Ex Vivo для вивчення біологічного протоколу ураження (перекладено німецькою мовою)

Резюме

Атеросклероз - це хронічний запальний процес. Цей рукопис ілюструє просту у використанні модель ex vivo для дослідження свіжих каротидних або коронарних бляшок серця. Модель ex vivo дозволяє досліджувати можливі речовини на запальне середовище при атеросклеротичних ураженнях людини, а результати можна досліджувати різними методами.

бляшки

Анотація

Вступ

Атеросклероз як хронічне запальне захворювання є однією з основних причин смертності в промислово розвинутих країнах 1/2. Ускладнення атеросклерозу, особливо гострого коронарного синдрому, пов’язані з розривом вразливих уражень, що призводить до атеротромбозу та оклюзії судин 3. Вроджений та набутий імунітет, як видається, бере участь у всіх етапах атерогенезу 2,4–5. Незважаючи на те, що були досягнуті значні успіхи у лікуванні інфаркту, ефективна профілактика атеросклерозу та серцево-судинних побічних ефектів досі не вирішена. Отже, вивчення біології з використанням трав є важливим для розширення наших знань про патофізіологію атеросклерозу та для ідентифікації нових терапевтичних цілей та розробки нових методів лікування.

У багатьох випадках для вивчення патофізіології конкретних захворювань використовують мишачі моделі. Однак вивчення атерогенезу за допомогою моделей мишей супроводжується кількома обмеженнями: (1) Як правило, атеросклеротичним мишам дають дієту з високим вмістом холестерину. Рівні холестерину в цих моделях не можна порівнювати з рівнями у пацієнтів з підвищеним рівнем холестерину в сироватці крові 6. (2) Існують значні відмінності між імунною системою мишей та людини; таким чином Foxp3 є специфічним маркером для регуляторних Т-клітин миші, тоді як експресія Foxp3 людини в Т-клітинах людини не обов'язково надає регуляторний фенотип 7. Також парадигма Th1/Th2, як у людей, не визначена для Т-клітин миші. Повністю передані клітини. (3) Набір маркерів, які використовуються для ідентифікації мишачих моноцитів та макрофагів, таких як F4/80 та маркери класичної (M1) проти альтернативної (M2) моделі активації, відсутніх у мієлоїдних клітинах людини 8. (4) Виявлено, що експресія генів мишачих та людських моноцитів у периферичній крові є важливою 9.

Отже, щоб глибше зрозуміти хронічні запальні процеси при атеросклерозі людини, нам потрібно використовувати моделі роботи з тканинами, кров’ю чи клітинами людини. Тут ми описуємо модель культури тканин людського нальоту, що дозволяє досліджувати можливі нові речовини в концепції запальної біології ураження людини.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

1. Готуйте середовище наступним чином

  1. Культуральне середовище: середовище RPMI.
  2. Станьте 10% фетальної телячої сироватки (FCS).
  3. З 100 ОД/мл пеніциліну G та 100 г/мл стрептоміцину.

2. Зберігайте циліндри зі свіжим нальотом до використання

  1. Операцію каротидної ендартеректомії пацієнтам з ішемічними симптомами або без них (інсульт, транзиторна ішемічна атака) зі значним сонним стенозом проводять судинні хірурги, а серцево-коронарну ендартеректомію під час операцій коронарного шунтування кардіохірурги. Сонні/коронарні бляшки повинні бути видалені блочно, щоб зберегти структуру нальоту, як описано вище 5.
  2. Після ерадикації нальоту помістіть зразок у пробірку із заповненою середовищем і зберігайте на льоду (наліт повинен бути повністю покритий середовищем) до використання.

4. Після встановленого часу збирання шматочків тканини нальоту

  1. Шокове заморожування шматочків нальоту для виділення мРНК та синтезу кДНК (детальнішу інформацію див. У Розділі 5 протоколу).
  2. Надосадову рідину зберігають при -20 ° C для аналізу ELISA.
  3. Для вестерн-блот, розбиття та лізису тканин нальоту. Фільтрують лізат через відцентровий фільтруючий пристрій 0,65 мкм та 0,1 мкм.
  4. Вставте наліт тканини в тканину-тек або парафін для фарбування імуногістохімії.

5. Вилучення РНК із культивованих шматків нальоту

  1. Використовуйте TissueLyser для гомогенізації.
  2. Виділіть РНК за допомогою набору (див. Таблицю матеріалів) відповідно до інструкцій виробника.
  3. Визначте кількість та якість РНК у зразках за допомогою спектрофотометра.
  4. Використовуйте комплект кДНК Boehringer для зворотної транскрипції відповідно до інструкцій виробника.
  5. Для кількісної ПЛР використовуйте, наприклад, набір ПЛР в режимі реального часу з ПЕЧ із SYBR Green.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

По-перше, ми показуємо залежні від часу зміни запальної сполуки нестимульованих культивованих атеросклеротичних уражень за допомогою кількісної ланцюгової реакції полімерази в реальному часі (qRT-PCR) (Ілюстрація 1) проаналізовано. Підвищення активності запального середовища ураження можна спостерігати під час вирощування нальоту. Через 3 год порівняно без культури різниці не виявлено (дані не наведені). Через 8 годин культури нальоту ми виявили лише незначну регуляцію деяких молекул, таких як IL-6, але не TNF-a та IFN-g, тоді як через 24 години відбулося регулювання різних молекул, таких як TNF a, IL-6 та IFN- Г. Примітно, що чим довший час культивування нальоту, тим більша різниця в молекулярній експресії.

По-друге, для того, щоб продемонструвати доцільність впливу на запальне середовище при атеросклеротичних ураженнях, ми представляємо результати шматочків нальоту з 1 мкг/мл LPS протягом 3 годин, виміряні за допомогою qRT-PCR (Малюнок 2) інкубують. Нестимульовані шматочки нальоту слугували негативним контролем. Ми виявили, що LPS індукує помітне збільшення ступеня активації запальної сполуки в межах атеросклеротичних уражень. Різні цитокіни (IL-6, TNF-a та ін.)., Рис. 2A-B), Хемокіни (CCL2 та ін., Не показано), адгезія (ICAM-1, не показано), дестабілізуючий наліт (матрикс-металлопептидаза 9 (MMP9), не показаний) та протромботичні молекули (фактор фон Віллебранда, 2С, Тканинний фактор не показано) регулювали інкубацією LPS.

По-третє, для оцінки кількості білка, рівні культивованих уражень аналізували методом ІФА, а тканини бляшок порушували методом Вестерн-блот (Рисунок 3D). В Рисунки 3A-C ми показуємо ІФА-аналіз IFN-g, MCP-1 і TNF-a в супернатанті культивованих зразків, інкубованих з LPS або контролем протягом 8 год. На додаток до Вестерн-блот-аналізу (фосфорильований) ERK 1/2 зруйнований і тканина нальоту лізується, або з контролем, стимульованим LPS, і в Рисунок 3D показано.

Обговорення

Тут ми представляємо модель культури бляшок ex vivo для дослідження впливу потенційно релевантних речовин на біологію атеросклеротичного ураження. Головною перевагою цих методів ex vivo є можливість оцінки впливу згаданих речовин на запальні клітини та їх взаємодії між клітинними та запальними шляхами та каскадами в атеросклеротичних ураженнях людини. Кілька корисних методів (наприклад, RT-PCR, вестерн-блот, імуногістохімія, проточна цитометрія, ІФА) допомагають створити всебічний аналіз впливу речовини, що представляє інтерес, на запалення атеросклеротичного ураження.

Запальні процеси при мишачому атеросклерозі добре зрозумілі, також завдяки мишачим моделям надмірної експресії або відсутності певних генів, що цікавлять 11. Однак результати не завжди відповідають тісно людині 6-9,13. Атеросклеротичні миші зазвичай отримують високопатологічну холестеринову дієту 6. Крім того, відомо, що імунна система між людьми та мишами демонструє суттєві відмінності 9,7. Тут ми представляємо модель культури бляшок ex vivo, яка дозволяє вивчити вплив речовини, що представляє інтерес, на інгібуючу сполуку при атеросклеротичних ураженнях людини, як описано Niessner et al. 14 показано. Крім того, різні додаткові методи можуть бути використані для аналізу результатів експерименту з культурою нальоту, порівнянного з дослідженнями на мишах. Отже, модель ex vivo відкриває можливість заміни досліджень мишей in vivo в деяких випадках і може представляти чудовий метод для подолання розриву між передбачуваною атеросклерозом, що стимулює молекулу в мишачій системі, та трансляцією в біології людини.

Модель людини атеросклерозу ex vivo не можна порівняти з експериментами in vitro на клітинах. Клітинні лінії можна легко зберігати та культивувати, але вони не є фенотипово та функціонально ідентичними первинним клітинам. Свіжі клітини можна отримати шляхом регулярного забору крові, але іноді це важко вирощувати, і культура піддається багатьом чинникам. Крім того, за допомогою експериментів in vitro на культурі клітин неможливо вивчити вплив специфічних молекул на інгібуючу сполуку при атеросклеротичних ураженнях. Таким чином, експерименти in vitro є важливими для початкового (поступального) етапу досліджень біології людини, але не для подальшого аналізу ролі молекули, що представляє інтерес, у концепції атеросклерозу людини, особливо взаємодії клітин та впливу на запальні каскади та шлях у атеросклеротичні ураження .

Монако та ін. Створено важливу короткочасну систему культури клітин, виділених із атеросклеротичної тканини людини 15. Ви використовували ферментативну суміш колагенази, еластази та ДНКази. Цей метод дозволяє досліджувати експерименти з клітинами на клітинах, аналіз шляхів передачі сигналів та дослідження передачі генів з аденовірусними векторами. Але залишається невідомим, як ферментативна суміш впливає на клітини, тобто ступінь активації, експресія поверхневих маркерів тощо. Крім того, сумнівно, чи відображають результати цих експериментів реальні процеси при атеросклеротичних ураженнях. Крім того, вихідне положення клітин буде зруйноване ферментативним змішуванням, а система короткочасного посіву має ті самі обмеження, що і для експериментів in vitro на клітинах.

Для конкретних досліджень клітин або популяцій клітин в межах атеросклеротичного ураження можна використовувати метод мікродисекції лазерного захоплення. Клітина або клітинна сполука, яка представляє інтерес, буде вирізана з тканини за допомогою інфрачервоного або УФ-лазера, і може бути проведений аналіз РНК, ДНК або білка. Мікродисекція лазерного захоплення, здається, не пошкоджує клітини, експресію рецепторів клітинної поверхні тощо. Перевагою методу є аналіз клітини або місця, що представляє інтерес, в межах атеросклеротичного ураження. Але неможливо додатково оцінити клітини, як дослідження in vitro.

Модель ex vivo базується на зразках ендартеректомії. Використання атеросклеротичних бляшок, отриманих від різних особин, може призвести до більших ступенів диференціального складу клітин і, отже, до більших коливань рівнів генів/білків, що нас цікавлять. Тому важливо використовувати нефібросклеротичні ураження 10 багатих ліпідами або ускладнених зразків нальоту, оскільки запальна реакція значно нижча при фібросклеротичних ураженнях. Тому великий інтерес представляє оцінка морфології нальоту перед аналізом результатів дослідів культури нальоту.

Крім того, кожен зразок містить різні стадії розвитку/прогресування атеросклеротичного ураження від початкової дисфункції ендотелію та етапу накопичення ліпідів до жирових прожилок та розвитку некротичного ядра до розриву бляшок. Таким чином, щоб мінімізувати неоднорідність тканин нальоту, необхідно вирізати поля, які зазвичай представляють ранні етапи атерогенезу.

Не можна виключати, що різання викликало пошкодження тканин. Але наші експерименти з культурою тканин нальоту показали порівнянну експресію генів культивованої тканинної бляшки з некультированою тканинною бляшкою. Отже, це підкреслює, що сучасний метод є хорошим інструментом для вивчення запального середовища при атеросклеротичних ураженнях.

Частини KulturPlaque обмежені періодом до однієї доби. Якщо тканину нальоту культивують більше доби, різниця в результатах різко зростає. Крім того, через 3 дні склад нальоту і морфологія руйнуються.

Існують обмеження, про які слід пам’ятати, застосовуючи цю модель. Модель ex vivo є хорошим методом для вивчення запального середовища при атеросклеротичних ураженнях. Проте важливі компоненти в цьому контексті відсутні. Жодні гемодинамічні властивості не застосовуються, а системний вплив повністю відсутній. Крім того, за допомогою цього методу можна вивчати лише короткочасні зміни, але він не має довгострокового аналізу через колапсу морфології нальоту.

На закінчення ми тут представляємо метод, який буде корисним для дослідників, які прагнуть вивчити потенційні нові молекули на запаленні атеросклеротичного ураження людини. Модель культури бляшок ex vivo не страждає від відмінностей між мишачою та людською імунною системою, але вона дає нам можливість проаналізувати взаємодію клітин у контексті атеросклеротичних уражень та надати можливість дослідити місцеві запальні каскади та шляхи ураження. Описаний тут метод культури нальоту бляшок ex vivo простий у використанні та відтворюваний і може допомогти виявити та підтвердити нові механізми захворювання та терапевтичні цілі.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Розкриття інформації

Автори не повинні розкривати будь-які конфлікти.