Модель печінки резус-мавпи, що відображає клінічний перебіг захворювання та аналіз

модель

  • Теми
  • Анотація
  • вступ
  • Результати
  • Ультразвукові та гістологічні особливості резус-мавп, що годували алкоголем
  • Характеристика хімії плазми у резус-мавп, що харчуються алкоголем
  • Зміни експресії печінкових генів у резус-мавп, що годуються алкоголем, зі стеатозом та фіброзом печінки
  • Обговорення
  • Методи
  • Введення тваринам та алкоголем
  • Збір крові та тести хімії плазми
  • Зразки УЗД та біопсії печінки
  • Гістологічний аналіз
  • Аналіз мікрочипів експресії генів печінки
  • статистичний аналіз
  • Додаткова інформація
  • коментарі

Теми

  • Алкогольна хвороба печінки
  • Метаболічний синдром

Анотація

вступ

Хронічна хвороба печінки, спричинена алкоголем, є основною причиною захворюваності та смертності у всьому світі 1. У розвинутих країнах до 66% хронічних захворювань печінки спричинені вживанням алкоголю, а зловживання алкоголем спричиняє майже половину всіх смертей від хвороб печінки 2. Отже, алкогольна хвороба печінки (АЛД) є головною проблемою охорони здоров'я, яка представляє важке медичне та економічне навантаження. Хронічна хвороба печінки, спричинена алкоголем, є прогресуючою хворобою з декількома гістологічними стадіями: жирова хвороба печінки (стеатоз), алкогольний гепатит, хронічний гепатит із фіброзом або цирозом печінки та гепатоцелюлярна карцинома 3. Однак етіологія АЛД до кінця не вивчена. На відміну від інших захворювань печінки, таких як вірусний гепатит, лікування АЛД значно не покращилось за 2 десятиліття. В даний час не існує ефективного та загальновизнаного лікування АЛД 4, 5. Розробка препаратів та методів терапії ALD ускладнюється відсутністю відповідних моделей тварин, що імітують як гістологічні, так і метаболічні характеристики ALD 2 у людини.

Результати

Шістнадцять макак-резусів годували спиртовим розчином протягом 3 років. Середньодобове споживання алкоголю протягом трирічного періоду становило 9,6 г/кг на день (діапазон: 6,2-12,1 г/кг на день), або 24% споживання калорій щодня (від 16% до 42%). Три контрольних тварини утримувались на однаковій дієті, але без алкоголю, і споживання їжі контролювали щодня.

Ультразвукові та гістологічні особливості резус-мавп, що годували алкоголем

Мавп-резусів тримали на алкогольній дієті протягом 3 років. Тварини, які годували алкоголем, демонстрували всі стадії АЛД на основі ультразвукового дослідження та гістологічної оцінки. УЗД печінки резус-мавп, які годували алкоголем, показало чітке ураження жирової тканини печінки та фіброз, на відміну від контрольних груп, які не годували алкоголем (рис. 1). Гістологічне дослідження зрізів печінки, пофарбованих H&E, виявило розвиток легкої, середньої та важкої жирової хвороби печінки з не запальними змінами у резус-мавп, що годуються алкоголем (рис. 2). На відміну від контрольних тварин, на ділянках печінки макак-резус, що харчуються алкоголем, спостерігався стеатоз, особливо гепатоцелюлярна вакуоляція та накопичення макро- та везикулярних ліпідів у гепатоцитах печінки (рис. 2в - h); також спостерігалося запалення та дегенерація балонів (рис. 2h). Крім того, при гістологічному дослідженні зрізів печінки, пофарбованих Массоном, виявлено фіброз печінки у резус-мавп, які годували алкоголем (рис. 3). Мавпи проходили стадії стеатозу та стеатогепатиту з різною швидкістю.

УЗД нормальної тканини печінки ( в ): Капсула печінки гостра і гладка з сильним, тонким, лінійним відлунням, а лінійне відлуння має невеликий зазор у стінці очеревини. Плями плями паренхіми печінки тонкі і рівномірно розподілені, система внутрішньопечінкових проток нормальна, текстура чітка, звук, що надходить, хороший. УЗД жирової тканини печінки ( , проти ): печінкова капсула гостра і гладка, а край печінки тупий. Внутрішньопечінкове відлуння тонке і щільно сплетене з нерівномірним відлунням. Внутрішньопечінкові судини були значно зменшені. УЗД тканини фіброзу печінки ( d - f ): поверхня печінки ( d ) неправильна і шорстка, а печінкова паренхіма нерівномірна з нерегулярними некротичними вогнищами ( e, f ).

Повнорозмірне зображення

Гістологічні особливості нормальної печінки резус-мавпи ( в, ) та резус-мавп, що годуються алкоголем, із легкою жировою хворобою печінки ( проти, d ), помірний ( e, f ) і важкий ( g, h ) (фарбування гематоксиліном та еозином). У гепатоцитах печінки може спостерігатися очевидна гепатоцелюлярна вакуоляція та накопичення макро- та везикулярних ліпідів. Стрілка на малюнку 2h вказує на інфільтрацію запальних клітин.

Повнорозмірне зображення

Гістологічні особливості нормальної печінки резус-мавпи ( а, б ) та резус-мавп, що годуються алкоголем, із фіброзом печінки ( c - h ). Відкладені колагенові волокна сильно забарвлюються трихромом Массона.

Повнорозмірне зображення

Характеристика хімії плазми у резус-мавп, що харчуються алкоголем

На основі оцінки гістологічних особливостей зрізів печінки тварин, які годували алкоголем, класифікували за стадією захворювання на основі тяжкості: легкий, середній та важкий стеатоз печінки та фіброз печінки. Також аналізувались функції печінки та ліпіди в сироватці крові, а кількість контрольних мавп, мавп з легкою, середньою та важкою жировою хворобою печінки та мавп із фіброзом становила 3, 3, 3, 6 та 3 мавпи відповідно (рис. 4а - h). . Концентрація АСТ у крові в сироватці крові у тварин із жировою печінкою та фіброзом печінки була підвищена порівняно з контрольною групою (Р 1); групи легкого, середнього та важкого ступеня стеатозу та фіброзу печінки вказували на наявність DAL у цих мавп (рис. 4г). За цей час концентрація GGT у плазмі крові у мавп із фіброзом печінки була значно збільшена (с

Хімічні параметри сироваткової плазми для GGT, AST, ALT, AST/ALT, LDH, ALP, TG та CHOL ( а - год ) у резус-мавп з нормальною печінкою (відкрита смуга) та резус-мавп, що харчуються алкоголем, із жирною печінкою (сірі смуги) та фіброзом печінки (чорна смужка). Різні верхні індекси над стовпцями вказують на суттєві відмінності (с

* Істотна різниця між контрольними мавпами-резусом та мавпами-алкоголіками з фіброзом печінки (P

Мікрочиповий аналіз зміни експресії генів печінки між контрольними макаками-резусом та макаками-резусом із жировою печінкою ( в ) та фіброз печінки ( ).

Повнорозмірне зображення

Обговорення

На закінчення ми охарактеризували резус-модель мавпоподібного стеатозу печінки, алкогольного гепатиту та індукованого алкоголем фіброзу печінки, що узгоджується з клінічним прогресуванням біохімії, патології та експресії печінки у людей з БА. Ця модель захворювання печінки у приматів, що не є людиною, буде корисною для поліпшення розуміння патогенезу АЛД та допоможе розробці нових терапевтичних процедур та нових фармакологічних реагентів для лікування АЛД.

Методи

Введення тваринам та алкоголем

Збір крові та тести хімії плазми

Зразки крові відбирали із стегнової вени мавп-резусів, знеболених хлоридом кетаміну (10 мг/кг; Shenyang Veterinary Pharmaceutical Inc., Китай), близько 9 години ранку після голодування 14 годин. Для хімічних тестів плазми сироватку крові відокремлювали центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 15 хв. Наступні хімічні параметри плазми вимірювали за допомогою автоматичного біохімічного аналізатора Roche Modular P800 (Roche Diagnostics Ltd., Базель, Швейцарія): γ-глутамілтранспептидаза (GGT, U/l), лактатдегідрогеназа (LDH, U/l), аспартатамінотрансфераза (AST, U/l), аланінамінотрансфераза (ALT, U/l), холестерин (CHOL, ммоль/л), тригліцериди (TG, ммоль/л). Аналізатор хемілюмінесценції ADC CLIA 400 (Addcare, Янтай, Китай) використовували для вимірювання плазмових маркерів фіброзу печінки, включаючи гіалуронову кислоту (HA), ламінін (LN), колаген IV (IV-C) та проміжний пептид проколагену III N (PIIINP) ).

Зразки УЗД та біопсії печінки

Гістологічний аналіз

Зразки тканини печінки, зібрані шляхом біопсії, ретельно фіксували у 10% нейтральному буферизованому формаліні та вносили у парафін. Вкладені в парафін тканини розрізали і фарбували розчинами гематоксиліну та еозину (H&E) та трихрому Массона (Masson). Зразки класифікували на основі накопичення жиру та відкладення колагену згідно з попереднім дослідженням досвідченого ветеринарного патолога, який не знав про лікування, яке отримували тварини 13. Коротко кажучи, м'який показник жиру (ступінь 1) вказував, що 10-15% гепатоцитів містили вакуолі, помірний показник жиру (ступінь 2) призначався, коли вакуолізація збільшувалася до 15-30%, і важкий рівень жиру (ступінь 3) . приписували, коли жир розподілявся на понад 40% гепатоцитів. Фіброз печінки характеризувався появою сильно забарвленого колагенового матеріалу.

Аналіз мікрочипів експресії генів печінки

статистичний аналіз

Хімічні параметри плазми виражали як середнє значення ± SEM. Параметри хімічної плазми (GGT, AST, ALT, співвідношення AST/ALT, CHOL, TG та LDH) у різних групах аналізували одностороннім ANOVA (програмне забезпечення SPSS, SPSS Inc., Чикаго, Іллінойс, США) та різницевим тестом (LSD ) був використаний для виявлення відмінностей. Тест Стьюдента використовували для виявлення відмінностей у рівнях маркерів у сироватці крові у контрольній та експериментальній групах. Для всіх аналізів, P