Модель відкладеного щеплення хронічного протоколу зараження раною синьогнійною паличкою (переклад

Резюме

Ми описуємо протокол відкладеного щеплення для вироблення хронічних інфекцій рани у імунокомпетентних мишей.

Анотація

Вступ

Синьогнійна паличка (P. aeruginosa) - це грамнегативна паличкоподібна бактерія, що зростає у значенні для здоров’я та захворювань людини. Він відповідає за поширеність захворюваності та смертності у внутрішньолікарняних умовах, особливо за участю раневих інфекцій у пацієнтів із ослабленим імунітетом 1, 2. Виникнення мультирезистентних штамів цього збудника надало додатковий поштовх для дослідження факторів, що сприяють вірулентності P. aeruginosa, механізмів антибіотикорезистентності P. aeruginosa та нових методів профілактики. інфекція 3. Таким чином, потреба в моделях хронічної інфекції рани на тваринах як інструментах для вивчення цих дослідницьких питань ніколи не була більшою.

На жаль, багато тваринних моделей інфекції P. aeruginosa, як правило, імітують гостру інфекцію з швидким усуненням інфекції або швидким спадом через сепсис 4, 5, що недостатньо імітує часто хронічну природу цих інфекцій. Щоб подолати цей недолік, деякі моделі використовують імплантацію сторонніх тіл, таких як агарові кульки, силіконові імплантати або альгінатні гелі 6, 7, 8. Інші моделі використовують мишей, які страждають на імунітет через похилий вік, ожиріння або діабет, або фармакологічними методами, такими як індукована циклофосфосфамідом нейтропенія 9, 10, 11, 12. Однак використання чужорідних матеріалів або ослаблених імунітетом господарів, ймовірно, змінює місцевий запальний процес, ускладнюючи розуміння патофізіології, пов’язаної з хронічними раневими інфекціями у господарів із нормальною імунною системою.

Ми розробили хронічну модель зараження рани P. aeruginosa у мишей, яка передбачає затримку інокуляції бактеріями після травми висічення. Відкладене щеплення дозволяє проводити експерименти з оцінки бактеріального навантаження, що тривають щонайменше до 7 днів. Ця модель відкриває нові можливості для вивчення як патогенезу, так і нових методів лікування хронічних інфекцій P. aeruginosa.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Всі описані тут методи були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин (IACUC) Стенфордського університету.

1. Підготовка та ріст бактерій

  1. Виконуйте всі роботи з P. aeruginosa та тваринами із застереженнями щодо BSL-2 згідно з Інституційним комітетом з питань біобезпеки та Комітетом з використання тварин. Виконайте всі описані тут дії із залученням P. aeruginosa, включаючи прищеплення мишей, у шафі з біобезпеки.
  2. Люмінесцентний штам PAO1: люкс P. aeruginosa доступний у нашій лабораторії за запитом. Смуга PAO1, зберігається у вигляді замороженого запасу гліцерину на агарі Lysogeny Broth (LB). Для люмінесцентного штаму PAO1: люкс агар LB повинен містити селективні антибіотики (100 г/мл карбеніциліну та 12,5 г/мл канаміцину). Вирощують при 37oC протягом ночі в бактеріальному інкубаторі.
  3. Виберіть ізольовану колонію і вирощуйте протягом ночі при 37 ° C у 3 мл середовища фунтів, рН 7,4. Для люмінесцентних штамів відвар повинен містити 100 од/мл карбеніциліну. Ростуть в струшуючих аеробних умовах.

2. Підготовка процедури

  1. Нехай усі працівники, які виконують операцію, носять чистий лабораторний халат/пальто, маску для обличчя, сітку для волосся та рукавички.
  2. Автоклавуйте всі хірургічні інструменти, включаючи ножиці та щипці. Використовуйте асептичну техніку для стерилізації інструментів між тваринами.
  3. Очистіть хірургічний стіл етанолом і приготуйте чисту хірургічну драпіровку.

3. Видалення волосся

4. Вирізання повної товщини рани

5. Щеплення на P. aeruginosa

6. Візуалізація інфікованих інфікованих ран

7. Післяопераційне ведення

  1. Спостерігайте за мишами відповідно до вказівок, встановлених протоколом IACUC дослідника. Ми спостерігаємо за всіма мишами щодня протягом перших 4 днів, потім через день до кінця експерименту. Зважуйте мишей один раз на день протягом перших 4 днів після операції в BSC. Введіть підшкірно 250 л 0,9% хлориду натрію на 1 та 2 день після зараження.
  2. Перевірте наявність у мишей ознак болю/дистресу, включаючи згорблену позу, пошарпану шерсть, млявість, утруднене дихання, гримаси обличчя та втрату ваги.
  3. Якщо тварини мають ознаки погіршення самопочуття, зверніться до ветеринара. Будь-яка миша, яка, як видається, має ознаки посилення болю/дистресу та втрати ваги на 20% або більше, повинна бути евтаназована.

8. Висічення травми

  1. В кінці експерименту жертвують мишей за допомогою інгаляції СО2 з подальшим вивихом шийки матки. Утилізуйте труп тварин згідно з протоколами установи ABSL-2.
  2. Виріжте ліжка з ранами за допомогою стерильних ножиць та щипців у BSC. Помістіть кожне ранове русло в 1 мл стерильного PBS у 1,5-міліметрову поліпропіленову пробірку. Подрібніть тканину рани ножицями. Усі рани слід обробляти як ASBL-2, навіть якщо вони не вважаються зараженими.
  3. Інкубуйте на шейкері при 300 об/хв протягом 2 год при 4 ° C. Викручуйте кожну пробірку протягом 10 с і послідовно розбавляйте бактеріальний стік у PBS. Помістіть розведені бактеріальні стоки на агар LB для перерахування бактеріального навантаження.
  4. Розглянемо інфіковані рани, якщо люмінесцентний сигнал у рані перевищує фонову люмінесценцію, і в стічних водах рани виявляється більше бактерій, ніж у ранах, інокульованих PBS як контроль.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

щеплення
Рисунок 1: Діаграма кліщів, що представляє модель висічення рани повної товщини із затримкою щеплення P. aeruginosabioluminescent. Смуга PAO1: люкс на день -2. Виберіть колонію в день -1 і вирощуйте протягом ночі на бульйоні LB. Виконайте операцію з висічення рани на -1 день. На 0 день інокулюйте PAO1: люкс, вводячи в ранне русло через прозору пов'язку. Виконайте зображення біолюмінесценції після щеплення. Повторюйте візуалізацію так часто, як щодня, до 7-10-го дня. На 7-10-й день жертвуйте тваринами та збирайте рани. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Рисунок 2: Схема операції з висіченням рани. Після епіляції воском та стерилізації шкіри спиртом та бетадином за допомогою 6-міліметрового біопсійного шила зробіть початковий розріз епідермісу лівої та правої спинки. За допомогою ножиць та щипців видаліть шкірні та епідермальні шари. Промити PBS. Накрити прозорою пов’язкою. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Ми розробили нову відстрочену модель щеплення інфекції рани P. aeruginosa. Стратегія затримки щеплення бактеріями на 24 години після пошкодження вирізання дозволяє оцінити раневі інфекції протягом одного тижня. Використовуючи люмінесцентний штам P. aeruginosa, можна стежити за прогресуванням інфекції протягом усього перебігу інфекції. Більш тривалий перебіг інфекції порівняно з іншими моделями зараження P. aeruginosa надасть нові можливості для вивчення взаємодій між господарем-збудником та нових методів лікування, спрямованих на зараження рани P. aeruginosa. Наприклад, ми раніше використовували цю модель, щоб продемонструвати роль бактеріофага Pf у стимулюванні противірусної імунної відповіді, що дозволяє P. aeruginosa уникати імунної системи господаря 14 .

Унікальним аспектом цього протоколу є висічення двох ран самостійно, а не згортання шкіри по середній лінії та пробивання, щоб створити дві двосторонні рани, як це має місце в деяких інших моделях ран. Ми виявили, що цей метод згортання також ефективний при отриманні симетричних ран з чистими полями. Однак миші, оброблені таким чином, зазвичай ставали септичними незабаром після бактеріального посіву і гинули. Ми вважаємо, що це може бути тому, що цей метод згортання видаляє шкірний carnosus panniculus - тонкий м’язовий шар, що лежить під шкірою мишей, якого немає у людини. Ми припускаємо, що цей бар’єр може допомогти запобігти поширенню бактерій.

Важливою частиною цього протоколу є достатня епіляція з місця хірургічного втручання, оскільки надлишки волосся можуть забезпечити гніздо для суперінфекції та перешкоджають адгезії прозорої плівкової пов’язки. Ми виявили, що гоління на додаток до крему для епіляції забезпечує оптимальну епіляцію з мінімальним подразненням шкіри, хоча все-таки добре змити крем теплою водою.

Іншим невід’ємним фактором є харчова підтримка, зволоження та контроль болю протягом перших днів після операції та зараження. Щоб виправити цю ситуацію, ми вводимо 500 мкл 0,9% хлориду натрію підшкірно в дні -1 та 0, потім 250 мкл в дні 1 та 2. Ми також пропонуємо рідкі полівітамінні та калорійні гелеві добавки під час хірургічної операції з травми. Як показано на малюнку 3Е, ці заходи дозволяють адекватно відновити вагу до третьої доби. Що стосується знеболення, ми виявили, що пролонговане вивільнення 0,5 мг/кг бупренорфіну, даного перед операцією з пошкодження висічення, забезпечує достатній контроль болю протягом 72 годин, але додаткові дози можуть надаватися, якщо це виправдано на основі результатів.

Хоча модель зараження P. aeruginosa на 7-10 днів є значною перевагою перед більш гострими моделями інфекції, цього все одно може бути недостатньо для відповіді на деякі питання: дослідження, що стосуються більш хронічних інфекцій. Однією з причин цього обмеження є те, що люмінесцентний сигнал штаму P.aeruginosa PAO1: люкс досягає максимуму на 2-3 день (рис.3)). Через 7 днів сигнал люциферази може стати ненадійним. З цієї причини ми визначаємо кількісні показники бактерій, висіваючи стоки з ран на пластини LB і підраховуючи КОЕ, щоб підтвердити зараження кожної рани в кінці експерименту. Іншим можливим недоліком цієї моделі є вимога до системи візуалізації in vivo, до якої деякі лабораторії можуть не мати доступу. Одним із способів обійти цю перешкоду є використання нелюмінесцентних штамів бактерій дикого типу. Це знову дозволяє досліднику скористатися цією моделлю хронічної інфекції, і, як зазначалося вище, контейнери для догляду за бактеріями можуть бути кількісно визначені в кінці експерименту.

Ми описали нову модель інфікування рани P. aeruginosa із затримкою, яка дозволяє проводити експерименти, що тривають 7-10 днів. Ця модель буде корисним інструментом для оцінки взаємодії хазяїн-збудник з P. aeruginosa, а також для розробки нових методів лікування. Ця модель має потенціал для багатьох майбутніх напрямків, включаючи адаптацію до інших збудників травм, таких як золотистий стафілокок, а також полімікробних інфекцій, включаючи P. aeruginosa, у поєднанні з іншими патогенами.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Розкриття інформації

Автори не мають конкуруючих фінансових інтересів для розголошення.