Насичені жирні кислоти індукують розвиток метаболічного синдрому та остеоартриту в

Теми

Анотація

вступ

Ожиріння - це надмірне накопичення жиру в організмі, яке є головним компонентом метаболічного синдрому, сузір’ям гіпертонії, діабету, дисліпідемії та жирової хвороби печінки, що збільшує ризик серцево-судинних захворювань 11. Хоча широко поширена думка, що АФС як група сприяє абдомінальному ожирінню, дисліпідемії, інсулінорезистентності, порушенню толерантності до глюкози та системному запаленню 12, ця роль АФС у ожирінні, діабеті та серцево-судинних захворюваннях нині ставиться під сумнів. Недавні дослідження показують, що реакції, викликані AGS, залежать від довжини ланцюга, з помітними різницями в біологічних реакціях між лауриновою кислотою та пальмітиновою кислотою 13. Однак ролі кожного дієтичного SFA при остеоартрозі чітко не визначені.

Наші попередні дослідження показали, що дієта з високим вмістом вуглеводів та жиру (Н; переважно фруктоза та яловичий жир) протягом 16 тижнів у молодих щурів Вістар імітувала симптоми метаболічного синдрому людини, включаючи абдомінальне ожиріння, збільшення загальної маси жиру, збільшення ліпідів та артеріальний тиск, порушення толерантності до глюкози та чутливості до інсуліну, стеатоз печінки та серцево-судинне ремоделювання 14. У цьому дослідженні вивчалася роль насичених жирних кислот від C12 до C18 (лауринова кислота (LA; C12: 0), міристинова кислота (MA; C14: 0), пальмітинова кислота (PA; C16: 0) та стеаринова кислота (SA; C18: 0), а також яловичий жир (переважно АС та транс-жирні кислоти) щодо ознак метаболічного синдрому та розвитку артрозу.

Результати

SFA на метаболічний синдром

Щури, яким давали високовуглеводну дієту, а також яловичий жир, що містив насичені та трансжири (H-дієта), виявляли зміни, пов’язані з метаболічним синдромом людини, включаючи абдомінальне ожиріння, гіперптидемію, гіперліпідемію та дисфункцію. C) (Таблиця C). 1) однак, щури Н не виявляли гіперглікемії або гіперінсулінемії у порівнянні з щурами С. Дієта С має низьку щільність енергії, і це може бути причиною того, що споживання їжі було більшим у щурів С, ніж у всіх інших групах. Хоча споживання їжі було вищим у щурів С, споживання енергії було вищим у всіх групах дієти з високим вмістом жиру, ніж у щурів С, у наступному порядку: С

( AT ) 3D-зображення колінного суглоба у щура та поперечний переріз реконструйованого осьового зрізу (вставки) області, що представляє інтерес, а саме бічне та бічне плато великогомілкової кістки, що відображає змінену субхондральну кісткову архітектуру (жовті стрілки показують морфологічні зміни). Для морфометричного аналізу ( ) Об'ємну частку кістки (BV/TV) розраховували як відношення сегментованого обсягу кістки (BV) до загального обсягу (TV) регіону, що цікавить. Крім того, була також розрахована мінеральна щільність кісткової тканини (МЩКТ) в регіоні, що нас цікавить ( VS ). Усі значення показані як середнє значення ± SD (P 2 (середнє значення OL), збільшене у щурів H, HPA та HSA порівняно з щурами C, що свідчить про збільшення обміну кісткової тканини та метаболізму мінеральних речовин, дерегульованих середньою щільністю HLA Щур HMA був дуже схожий на щурів C. Знижена присутність середніх ядер остеоцитів (середня OS.N) у щурів H, HMA, HPA та HSA порівняно з щурами С припускає смерть від апоптозу, спричиненого дієтами на остеоцитах (Додаткова таблиця 2).

AFS на хондроцитах людини та експлантатах хряща великої рогатої худоби

Рівні мРНК ( AT ) ACAN, ( ) COL10A, ( VS ) MMP13, ( D ) ADAMTS4, ( Е ) ADAMTS5 та ( F ) RUNX2 оцінювали за допомогою RT-PCR як у пацієнтів, які не отримували IL-1β, так і IL-1β. гранули. Всі експериментальні зразки проводили у трьох примірниках. Всі значення представлені як середнє значення ± SD (P

Обмеження цього дослідження включають той факт, що ми не вимірювали морфологічних змін у синовіальній оболонці або змін концентрації цитокінів у синовіальній рідині. Ці два додаткові параметри можуть сприяти розумінню місцевих змін, спричинених запаленням у раціонах SFA, і, отже, покращити розуміння остеоартриту, спричиненого ожирінням.

На закінчення це дослідження наводить докази того, що АФС може спричинити подібні зміни в метаболічному синдромі та артрозі. Ці зміни корелюють із рівнем лептину та інсуліну в плазмі крові, які пов’язані з ожирінням, діабетом 2 типу та артрозом. Наші дані дозволяють припустити, що заміна традиційних дієт, що містять ЛА, отриману з кокосового горіха, ПА, отриманою з пальмової олії, або АС, отриманою з тваринного жиру, може погіршити розвиток метаболічного синдрому та артрозу. Крім того, необхідні клінічні випробування на людях, щоб визначити, чи заміна ПА та СА в дієті на АЛ пом'якшить або скасує розвиток ОА та метаболічного синдрому, особливо ожиріння та гіпертонії.

Методи

Вивчіть дизайн та дієти

Вимірювання метаболічних змінних

Щоденні вимірювання маси тіла та споживання їжі та води проводились для моніторингу щоденного стану здоров’я щурів. Ефективність перетворення корму (%) розраховували, як описано раніше 14. Відсоток збільшення маси тіла за 16 тижнів обчислювали як різницю у вазі між днем 0 і днем 112. Окружність живота вимірювали кожні 4 тижні, використовуючи стандартну рулетку, під легкою анестезією Золетилом (пілетаміну 10 мг/кг, золазепаму 10 мг/кг внутрішньовенно; внутрішньовенно; Вірбак, Пікхерст, Новий Південний Уельс, Австралія).

Через 16 тижнів щурів евтаназували Lethabarb ® (100 мг/кг пентобарбіталу натрію, внутрішньовенно). Після евтаназії збирали кров для виділення плазми, і плазму зберігали при -20 ° C перед подальшим аналізом. Серця ізолювали для проведення підготовки серця Лангендорфа для вимірювання діастолічної константи жорсткості 14. Потім такі тканини, як печінка, лівий шлуночок (з перегородкою), правий шлуночок та черевні жирові прокладки (включаючи заочеревинну, епідидимальну та сальникову тканини), брали для зважування та виражали в мг/мм в довжину великогомілкової кістки. Плазмові концентрації лептину, інсуліну, загального холестерину, тригліцеридів та нестерифікованих жирних кислот (NEFA) вимірювали, як описано раніше 14 .

Оцінка хряща суглоба

Тест апоптозу TUNEL

Кінцева дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT) dUTP Nick-End мітка (TUNEL) була використана для ідентифікації клітин, що виявляють деградацію ДНК під час апоптозу. Зрізи тканин спочатку проникли протеїназою K протягом 30 хвилин при 37 ° C. Потім предметні стекла промивали PBS і аналіз проводили за протоколом виробника (Roche, Німеччина). Зрізи інкубували з DNase1 протягом 10 хвилин при кімнатній температурі як позитивний контроль. Для напівкількісного аналізу даних підраховували та нормалізували позитивні клітини з різних полів зору на основі кількості клітин на 100 клітин у кожній групі, використовуючи ImageJ (NIH, Bethesda, MD) 39 .

Оцінка змін субхондральної кістки

Для аналізу змін у субхондральній кістці було проведено мікро-КТ. Стегнову кістку та гомілку сканували за допомогою мікро-КТ (Scanco μCT 40, Scanco Medical, Швейцарія) з ізотропним розміром вокселя 18 мкм при напрузі 55 кВ та струмі 145 мкА з алюмінієвим фільтром 0,5 мм. Час експозиції становив 1180 мс, а вбудоване програмне забезпечення Scanco використовувалось для сегментації набору даних 39. Ручні області, що представляють інтерес (ROI), були намальовані навколо анатомічного контуру субхондральної кісткової області бічного та медіального плато великогомілкової кістки. Обсяг відсотків (VOI) складався з набору рентабельності інвестицій (25 перерізів). VOI починався нижче субхондральної пластинки, яка простягалася дистальніше до пластини росту. Розраховано співвідношення об’єму кістки до загального об’єму (BV/TV) та мінеральної щільності кісткової тканини (BMD) VOI.

Аналіз на остеоцити

Порожні вакансії середніх остеоцитів (середнє значення OSL) та ядро середнього остеоцита (середнє значення OSN) підраховували на одиницю площі (мм2) у субхондральній кістковій області медіального плато великогомілкової кістки за допомогою ImageJ (NIH, Bethesda, MD).

Лікування експлантатів хондроцитів та хрящів SFA

Підготовка ДФЗ

LA, MA, PA і SA були придбані комерційно з найвищою доступною чистотою (Sigma-Aldrich, GC очищений, хімічно синтезований). В якості носія був обраний бичачий сироватковий альбумін (BSA) (без жирних кислот, Sigma Aldrich). Розчини комплексу SFA-BSA отримували за протоколом, описаним раніше 6. Окремі SFA розчиняли у 100% етанолі при 70 ° C, отримуючи 200 мМ вихідний розчин. Потім вихідний розчин розбавляли 1:10 у 10% (мас./Об.) BSA, приготовленому модифікованим середовищем орлиного (DMEM) Дульбекко, протягом 10 хвилин при 55 ° C. Отриманий розчин SFA (20 мМ) стерильно фільтрували (0,45 мкМ фільтр ) перед нанесенням на культури клітин за протоколом, описаним раніше 6. Контроль транспортного засобу (негативний контроль) був BSA без жирних кислот з тією ж концентрацією етанолу.

Культура гранул хондроцитів та експлантатів великої рогатої худоби

Хондроцити збирали ферментативним травленням і культивували згідно з нашими опублікованими протоколами 39. Коротко, біопсії суглобового хряща були отримані у первинних хворих на ОА, які перенесли операцію із заміщення коліна в лікарні Принца Чарльза (Брісбен, QLD, Австралія). Усі біоптати хряща були взяті з частини поверхні виростка стегнової кістки, яку хірург вважав схожою на цілий та здоровий хрящ. П’ятьма донорами були чоловіки у віці 60–65 років, і всі вони надали письмову інформовану згоду. Дослідження було схвалено Госпіталем принца Чарльза та Комітетами з людської етики Квінслендського технологічного університету. Кожен зразок хряща був далі охарактеризований та оцінений за шкалою Манкіна, для подальших експериментів використовувались лише зразки з оцінками 0–1 (здоровий хрящ).

Хрящ розтинали з кістки і розщеплювали розчином колагенази 2 (Invitrogen, Lakewood, NJ) протягом ночі в культуральному середовищі DMEM для виділення хондроцитів суглобового хряща (ACC). Після перетравлення АСС (2,5 × 10 5 клітин) гранулювали центрифугуванням у 15 мл пробірках Falcon і культивували в тривимірній (3D) системі культирування гранул 39 протягом 14 днів у хондрогенному середовищі за наявності або відсутності різних SFA.

Для досліджень експлантатів великої рогатої худоби в день забою були отримані свіжі колінні суглоби дорослої худоби (n = 3). Потім товщину суглобових хрящових експлантатів без субхондральної кістки збирали з колінних суглобів. Потім хрящові диски асептично розтинали за допомогою 4-мм шкірного штампу. Диски культивували в DMEM і додавали 10% фетальної бичачої сироватки (FBS) та антибіотики при 37 ° C з 5% CO 2 протягом 48 годин.

Потім гранули та диски стимулювали кожним SFA (кінцева концентрація: 30 мкг/мл, отримана з аналізу MTT - дані не наведені). Негативний контроль, в який не додавали SFA, обробляли лише BSA-носієм. Для вивчення ефектів SFA та запальних цитокінів деякі гранули АСС та диски хряща великої рогатої худоби обробляли IL-1β (10 нг/мл) у присутності або відсутність різних SFA. Через 3 і 7 день середовища збирали і зберігали при -80 ° C для кількісного визначення сульфатованих глікозаміногліканів. Пізніше хрящові диски та гранули АСС були оброблені для гістологічного аналізу та кількісного ПЛР-аналізу в реальному часі (qPCR). Для подальшої оцінки відповідей на певні SFA до гранул хондроцитів додавали різні концентрації (10 мкМ, 30 мкМ, 60 мкМ і 90 мкМ) PA і SA як у відсутність, так і в присутності IL-1β (10 нг/мл ). Через 3 і 7 день середовища збирали і зберігали при -80 ° C для кількісного визначення сульфатованих глікозаміногліканів (sGAG). Крім того, для оцінки ефектів IL-1β, що використовувались у цьому дослідженні, гранули хондроцитів обробляли різними концентраціями IL-1β (1–10 нг/мл). День 3 та день 7 середовища збирали та зберігали при -80 ° C для кількісного визначення sGAG.

Аналіз сульфатованих глікозаміногліканів (sGAG)

Для вимірювання вивільнення sGAG супернатанти відбирали з лунок, що містять диски хряща великої рогатої худоби або гранули хондроцитів, оброблені SFA або без них у день 3 та день 7. SGAG вимірювали, використовуючи метод диметилметиленового синього (DMB) із набором (Blyscan ™ Biocolor Ltd), дотримуючись інструкцій виробника. Зона виснаження sGAG в експлантатах хряща була визначена за допомогою зображень фарбування Safranin O та виміряна за допомогою ImageJ (NIH, Bethesda, MD).

Вилучення РНК та ПЛР у режимі реального часу

Загальну РНК екстрагували за допомогою реагенту TRIzol (Invitrogen), обробляли ДНКазою та очищали згідно з протоколом виробника за допомогою RNeasy Mini Kit (Qiagen). кДНК синтезували з 1 мкг загальної РНК згідно з протоколом виробника за допомогою набору для синтезу кДНК SensiFAST. Кількісна ПЛР у режимі реального часу з використанням хімії виявлення SYBR Green проводилася на системі ПЛР ABI 7500 Fast Real Time (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США). Були проведені аналізи кривої розплаву всіх продуктів ПЛР у режимі реального часу, і було показано, що вони отримують єдиний дуплекс ДНК. Всі зразки вимірювали в трьох примірниках, а середнє значення всіх експериментальних зразків розглядали для порівняльного аналізу. Кількісні вимірювання всіх праймерів, що використовувались у цьому дослідженні, визначали методом (2 -ΔΔ Ct), а 18 с та експресію β-актину використовували як внутрішній контроль, як описано раніше нашою групою 39, 41, 42, 43 .

Статистика

Статистичний аналіз проводили за допомогою Graphpad Prism. Дані представлені як середнє значення ± стандартне відхилення (SD) для всіх змінних та проаналізовані методом ANOVA. Для оцінки статистичної значущості використовували дисперсійний аналіз дисперсії із тестами post hoc (Dunnett's/Bonferroni). Рівень значущості був встановлений на рівні Р