Нова фотоакустична мікроскопія та оптична когерентна томографія Двомодальна хоріоретинальна візуалізація

Резюме

Цей рукопис описує нову структуру та роботу системи фотоакустичної мікроскопії та оптичної когерентної томографії з подвійною модальністю для неінвазивної хоріоретинальної візуалізації більших тварин, таких як кролики, без міток.

Анотація

Вступ

Останні кілька десятиліть спостерігалися вибухові розробки в галузі біомедичних фотоакустичних зображень 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7., 8-е. Засноване на перетворенні енергії світла в звук, що виникає фотоакустичне зображення візуалізує біологічні зразки в масштабах органел, клітин, тканин, органів, цілих тіл дрібних тварин і може розкрити його анатомічну, функціональну, молекулярну, генетичну та метаболічну інформацію 1, 2, 9, 10, 11, 12. Фотоакустична візуалізація знайшла унікальне застосування в ряді біомедичних областей, клітинній біології 13, 14, біології судин 15, 16, неврології 17, 18., Онкологія 19, 20, 21, 22, Дерматологія 23, Фармакологія 24 та Гематологія 25, 26. Застосування його в офтальмології, d. H. фотоакустичне очне зображення привернуло значний інтерес з боку вчених та клініцистів і в даний час активно вивчається.

З цією метою нещодавно ми повідомляли про неінвазивну хоріоретинальну візуалізацію без ярликів у живих кроликів за допомогою інтегрованої фотоакустичної мікроскопії (PAM) та OCT із спектральним доменом (SD-OCT) 38. Система має відмінні показники та змогла візуалізувати сітківку та судинну оболонку очей великих тварин на основі ендогенного поглинання та розсіювання контрасту очної тканини. Попередні результати у кроликів показують, що PAM може неінвазивно диференціювати окремі судини сітківки та судинної оболонки за допомогою дози лазерного впливу (

80 нДж) значно нижче безпеки Американського національного інституту стандартів (ANSI) (160 нДж) при 570 нм- 39; і інструмент Office Fitting Tool міг чітко вирішити різні шари сітківки, судинної оболонки та склер. Це перша демонстрація зображень заднього сегмента великих тварин з ПАМ і, можливо, важливий крок до клінічного перекладу, враховуючи, що розмір очного яблука у кроликів (18,1 мм) 40 становить майже 80% від осьової довжини технології людини (23, 9 мм).

У цій роботі ми надаємо детальний опис системи двомодальної візуалізації та експериментальних протоколів, що використовуються для неінвазивної хоріоретинальної візуалізації хоріоретинальних зображень у живих кроликів, і демонструємо ефективність системи за допомогою репрезентативних результатів візуалізації сітківки та хоріоїда.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Кролики охоплені видами Міністерства сільського господарства США (USDA). Його використання в біомедичних дослідженнях має бути суворо регламентованим. Усі експерименти на кроликах проводились відповідно до Декларації ARVO (Асоціація досліджень зору та офтальмології) щодо використання тварин у офтальмологічних та зорових дослідженнях після затвердження університетом протоколу лабораторії тварин. Комітет Мічиганського університету з питань використання та догляду за тваринами (UCUCA) (протокол PRO00006486, П.І. Янніс Паулус).

  1. Оглянувши очне дно, використовуйте камеру очного дна, щоб відокремити V-гель, якщо він підключений. Промити око промиванням очей, нанести офтальмологічний флурбіпрофен та неоміцин та сульфати поліміксину В та офтальмологічну мазь дексаметазон та закрити очі.
  2. Перенесіть кролика з ковдрою води, що циркулює, у камеру для відновлення. Захистіть вміст коробки від світла і почекайте, поки кролик прокинеться природним шляхом. Протягом цього часу слідкуйте за внутрішніми органами тварин кожні 15 хвилин і зберігайте запис і об'єкт для тварин знову копію для архівування.
  3. Як тільки кролик прокинеться і стане активним, насторожений і нормально ходить, перевезіть його назад до приміщення для тварин. Якщо планується гострий експеримент, евтаназуйте тварину розчином евтаназії (наприклад, бевтаназію, 0,22 мл/кг, внутрішньовенне введення у крайову вушну вену) і викиньте тушку.
  4. Увімкніть програмне забезпечення та лазери. Очистіть оптичний стенд.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Двомодальна система візуалізації та експериментальний протокол були успішно випробувані в лабораторії авторів з чотирма новозеландськими білими кроликами. Далі наведено деякі репрезентативні результати.

ілюстрація 1 показує схему подвійної модальності системи зображення PAM і SD-OCT. Він складається з наступних модулів: фотоакустичне джерело світла, змінний лазерний аттенюатор, коліматор променя, лічильник енергії, скануюча головка, модуль фотоакустичного виявлення та збору, пристрій ОКТ та синхронізована електроніка. Детальні конфігурації системи детально описані в Розділі 1.1.

Малюнок 2 показані типові результати візуалізації судин судинної оболонки кроликів, отриманих за допомогою двомодальної системи візуалізації. Малюнок 2 (а) - це фотографія очного дна, яка показує, що судини хоріоїдної клітки розподілені по більшій частині очного дна кролика, тоді як судини сітківки розташовані в межах медулярного променя. Малюнок 2 (b) - це типове зображення PAM, що показує судинну оболонку судинної оболонки на фотографії очного дна. Судини хоріоїдної оболонки були розмежовані з високим бічним дозволом. Малюнок 2 (c) - це ОКТ-скановане зображення, отримане для того, щоб ви могли поглянути на анатомію очного дна і підтверджує наявність судинної оболонки судин. Сітківку, судинну оболонку та склеру можна було візуалізувати з високою осьовою роздільною здатністю з судинними оболонками судин під пігментним епітелієм сітківки (RPE).

Малюнок 3 показує типові результати візуалізації судин сітківки кроликів, отриманих із використанням подвійної модальної системи візуалізації. Малюнки 3 буква а і Номер 3, буква b 2D MIP та 3D об'ємне зображення судин сітківки отримують за допомогою PAM відповідно. Малюнок 3 (c) показує ортогональні фрагменти тривимірного зображення. Результати показують, що PAM також може візуалізувати окремі судини сітківки, які лежать вище рівня RPE, і підтверджують, що судини сітківки та судини хоріоїдальної оболонки знаходяться на різній глибині. Малюнок 3 (d) показує відповідне зображення OCT B, показує поперечні зрізи окремих судин сітківки та шар нервових волокон (NFL).

нова

ілюстрація 1. Схема інтегрованої фотоакустичної мікроскопії та оптичної когерентної томографії двомодальної системи візуалізації. OPO: оптичний параметричний генератор; BS: роздільник балки; PD: фотодіод; М: дзеркало; DM: дихроїчні дзеркала; SL: об'єктив сканування; ПР: офтальмологічна кришталик; SMF: одномодовий волокно; DCG: скло для компенсації дисперсії; CCD: зарядний пристрій - в поєднанні. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

мікроскопія

Малюнок 2. Двомодальна візуалізація PAM та OCT судинної оболонки судинної оболонки кролика. (а) Фотографія очного дна показує, що цілі судини хоріоїдальної оболонки (CV) розсіяні, тоді як судини сітківки (RV) знаходяться в межах медулярного променя, оскільки кролики є мерангіотичними тваринами. (b) Зображення резюме PAM C, що показує, що PAM може обмежувати резюме до високої бічної роздільної здатності. (c) B-зображення OCT показує анатомічну структуру очного дна кролика та осьове положення судин хоріоїдальної оболонки. GCL: гангліозний клітинний шар; INL: внутрішній ядерний шар; IPL: внутрішній плексиформний шар; ONL: зовнішній ядерний шар; OPL: зовнішній плексиформний шар; OLM: зовнішня обмежувальна мембрана; EZ: Еліпсоїдна зона; МЗ: міоїдна зона; ОС: зовнішній сегмент; Б.М., мембрана Бруха; IZ: зона міждигітації 38. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

нова

Малюнок 3. Двомодальна візуалізація PAM та OCT судин сітківки у кроликів. (a) PAM C зображення RV та CV. (b) 3D об'ємний візуалізація зображення PAM. (c) 2D ортогональні зрізи зображення PAM показують RV та CV на різній глибині. (d) Зображення OCT B, на якому показано RV, NFL та склеру 38. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Незмінна та регулярна слізна плівка необхідна для високоякісних зображень очного дна. Нерегулярні та погіршені плівки, що рвуться, можуть суттєво вплинути на якість зображення 42. Щоб уникнути цілісності слізної плівки та поверхневої точкової кератопатії рогівки, важливо дуже часто змащувати рогівку промиванням очей, приблизно кожні дві хвилини. Якщо є будь-які занепокоєння щодо помутніння ока, використовуйте щілинну лампу та флюоресцеїнові смужки для перевірки стану рогівки.

Для зображень заднього сегмента очей більших тварин може існувати кілька труднощів, включаючи згасання фотоакустичного сигналу з відстанню, особливо для високочастотних компонентів, зневоднення рогівки та оптичні аберації. Амплітуда фотоакустичного сигналу зазвичай відчуває значне послаблення, перш ніж його виявляє голчастий ультразвуковий перетворювач. Чим більше очне яблуко, тим більше загасання. Розмір очного яблука кролика (

18,1 мм) приблизно втричі більший, ніж у щурів, і в шість разів більший, ніж у мишей, що особливо ускладнює візуалізацію очей кролика. Для розумної якості зображення кращим є лазерний промінь малого діаметру (2 мм після променя коліматора в цьому дослідженні) та колімований фронт хвилі (ідеально плоский хвильовий фронт), оскільки він буде мінімально впливати на внутрішні оптичні аберації рогівки і цілком може впливати на сітківку ока бути зосередженим. Цей момент має вирішальне значення з точки зору зменшення дози лазерної експозиції та покращення роздільної здатності зображення. Крім того, ультразвуковий перетворювач із центральною частотою 27 МГц, а не з вищою центральною частотою, заснований на експериментальних результатах, вказує, що це максимальний ультразвуковий сигнал на цій відстані.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Розкриття інформації

Автори нічого не розкрили.

Подяка

Ця робота була підтримана щедрою підтримкою Національного інституту очей 4K12EY022299 (YMP), Міжнародного фонду досліджень сітківки Fight Fight GIF16002 (YMP), повною відомчою підтримкою досліджень з профілактики сліпоти та відділу офтальмології Університету Мічигану. та візуальних наук. Ця робота використовувала основний центр для бачення досліджень P30 EY007003, що фінансуються Національним інститутом очей.