Новий метод моделювання хронічної травматичної енцефалопатії у протоколі дрозофіли (переклад на англ

Резюме

Тут ми описуємо новий підхід до нанесення травматичної черепно-мозкової травми у Drosophila melanogaster. Наш метод має перевагу в тому, що безпосередньо забезпечує повторювані удари з регульованою силою лише на голову. Подальше дослідження системи безхребетних допоможе пролити світло на патогенез хронічної травматичної енцефалопатії.

Анотація

Вступ

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

1. Складання ударного елемента (рис. 1 )

2. Робота ударного механізму

Знеболіть одну дорослу жіночу муху віком 2 дні, використовуючи CO 2 на оболонці.
Акуратно поверніть його на мухотримач за допомогою тонкої щітки. Акуратно постукайте по тримачу, щоб голова мухи була видна за межами наконечника. Якщо мухопробоскоп відкритий на зовнішній стороні наконечника, обережно витягніть його всередину наконечника за допомогою тупої 1 мл шприцевої голки.
ПРИМІТКА: Переконайтеся, що хоботок тримається всередині тримача. В іншому випадку муха може загинути від травми хоботного всмоктування.
Затягніть муху Хо Підніміть ствол шприца за допомогою роз'єму так, щоб голова мухи була звернена вниз.
Встановіть тиск газу на 100 кПа. Відрегулюйте швидкість потоку відповідно до плану експерименту.
Швидко поверніть кнопку регулятора витрати ще раз, щоб ударний елемент ударив об головку мухи один раз.
Підніміть тримач для мух і перемістіть його на оболонку. Поверніть утримувач мухи і обережно постукайте по боці, щоб впустити муху. Залиште муху в порожній пляшці для збору.

3. Відстеження руху за допомогою відео

Наповніть чашку Петрі діаметром 6 см прозорим кремнієвим еластомером, щоб зробити арену для відстеження. Залиште 3 мм зазору між кремнієм та кришкою посуду, щоб мухи могли вільно ходити, але не літати.
Кожен раз знеболюйте чотирьох мух з підробленої або обробленої групи та розміщуйте їх на арені. Залиште мух при 22 ° C на 1 годину.
Розташуйте камеру із зарядним пристроєм (CCD) над аренами та знімайте протягом 5 хв.
Проаналізуйте записані траєкторії руху за допомогою програмного забезпечення Ctrax (безкоштовно в Caltech) 16. Експортуйте відстежувані дані у формат, сумісний з мовою програмування (наприклад, Matlab), та проаналізуйте дані відповідно до пройденої відстані за кадр 17. Обчисліть середню пішохідну відстань для кожного польоту та поєднайте її з усіма іншими записаними мухами/групами, щоб отримати середню сукупну відстань, пройдену популяцією файлів у тій самій групі.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Для оцінки довгострокових наслідків множинних травм мозку ми застосували протокол mTBI з п’яти послідовних ударів зі швидкістю потоку 5,0 л/хв з періодами відновлення 24 години між кожним ударом. Досліджуючи вплив mTBI на функцію руху, ми використовували відеосистему відстеження руху для аналізу поведінки двигуна мухи. Після старіння мух через 20 днів після лікування група, яка отримувала mTBI, продемонструвала знижену активність ходьби та пройдену відстань порівняно з групою тренажера (Рисунок 4 AT і ; змодельована група: 6,49 ± 0,72; n = 28 щодо обробленої групи: 4,3 ± 0,47, n = 32; p фігура 4C, порівняно з групою тренажера (n = 129), оброблені мухи (n = 100) мали значно зменшену медіану тривалості життя (36,9 ± 2,7 проти 26,3 ± 0,9 д) і тривалість значно зменшеного максимального життя (49,3 ± 2,4 проти. 34,7 ± 1,4 г).

1 "class =" xfigimg "src ="/files/ftp_upload/55602/55602fig1.jpg "/>
Фігура 1 . Схема ударного механізму. В апараті використовувались матеріали, доступні в лабораторії дрозофіли: 1) наконечник піпетки на 200 мкл, 2) туберкуліновий шприц 1 мл, 3) ударник, 4) з’єднувальна трубка, приєднана до анестезіологічної станції дрозофіли та 5) роз’єм для затягування наконечника на шприц. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Малюнок 2 . Погано закрита травматична травма голови. Одноразовий удар при найвищому потоці газу не мав явних зовнішніх пошкоджень голови, тіла або придатків. ( AT ) Крадіжка, завдана страйком. ( VS D ) Фальшива муха. Імітовані польоти проходили точно такі ж процедури, як і оброблена група, включаючи перенесення на і з літака-носія, за винятком того, що при застосуванні потоку СО2 в ствол шприца не поміщався ударник Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Малюнок 3 . Ефект одного удару. ( AT ) Індекс виживання за 24 години (SI 24), що визначається як відсоток мух, які вижили протягом 24 годин після удару, будується графіком щодо швидкості потоку газу. Мухи, які були вражені один раз з руховою активністю, відновленою потоком газу 5,0 л/хв через 4 хв ( ), і їх рухливість повільно нормалізувалась протягом 2 днів ( VS) . Панель помилок, стандартна помилка середнього значення (SEM). Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Малюнок 4 . Розробка моделі mTBI в Дрозофіла . Повторні страйки протягом п’яти днів призвели до рухової активності ( А і В ) та скорочений термін служби ( VS ). Репрезентативні пішохідні доріжки, записані протягом 5 хвилин для 4 змодельованих та оброблених мух, показані в A. Бари помилок, SEM. * Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Моделі на тваринах, які достовірно відображають характеристики КТР, включаючи нейрофізіологічні зміни, невропатологічні особливості та дефекти нейро-поведінки, мають важливе значення для розкриття механізмів захворювання та для розробки діагностичних та терапевтичних цілей. Зрозуміло, що жодна тваринна модель захворювання людини не є ідеальною для імітації всіх клінічно значущих кінцевих параметрів. Однак ми вважаємо, що надійна модель КТР повинна відповідати наступним трьом вимогам: (1) удар слід застосовувати безпосередньо до голови, яка має неушкоджену захист шкіри голови та черепа; (2) голова не повинна бути знерухомлена під час впливу удару, так що дозволяється швидке прискорення-уповільнення та обертальні та лінійні рухи голови; І (3) експериментальна конструкція повинна включати одноразові та повторювані схеми, а наслідки удару повинні бути м'якими за своєю суттю, не завдаючи видимих пошкоджень, таких як набряк тканин, контузія або тупе крововилив.

Хоча для управління регулятором потоку СО2 ідеально встановити автоматичний вимикач увімкнення/вимкнення, поточний ручний перемикач, схоже, не впливає на повторюваність ударної сили, оскільки конструкція нашого пристрою - це все. Сила повинна здійснюватися швидко як тільки ударник вдаряється об голову.

Таким чином, наша система пропонує нову схему для кращого імітації mTBI, представляючи нову платформу для моделі CTE. Як і інші моделі дрозофіли, які виявилися корисними для розшифровки нейродегенеративних розладів людини 9, 20, очікується, що детальна характеристика моделі продовжиться з точки зору втрати нейронів, тау-гіперфосфорилювання, протеїнопатії TDP -43 та нейрозапальної реакції на спричинені mTBI. важливу механістичну інформацію про процеси захворювання на КТР та допоможе відповісти на деякі найважливіші питання у цій галузі.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Розкриття інформації

Цю роботу підтримав Насінницький фонд медичної школи Університету Джона Хопкінса при LC