Оптимізація ефективності ендотеліальної диференціації позитивних стовбурових клітин CD133 людини -

1 Від Медичної клініки та поліклініки II Онкологічного центру Університетського медичного центру Гамбург-Еппендорф Оптимізація ефективності ендотеліальної диференціації позитивних стовбурових клітин CD133 людини Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медицини в медичному відділі Гамбургського університету, представлена ​​Естель Йонго з Камеруну, Гамбург, 2008

ефективності

2 2 Прийнято медичним факультетом Гамбурзького університету: Надруковано з погодження з медичним факультетом Гамбургського університету Іспитна комісія, голова: Іспитна комісія, 2-й рецензент: Екзаменаційна комісія, 3-й рецензент: Проф. В. Фідлер проф. Д-р Х. Кабіш проф. Д-р Н. Крегер

4 4 H ПОДЯКА I ФЕДЕРАЛЬНА ДЕКЛАРАЦІЯ J СПИСОК ФІГУР К СПИСОК СКОРОЧЕНЬ СПИСОК ТАБЛИЦ

23 23 уражені гемопоетичними стовбуровими клітинами. З цією метою частину клітин потрібно висадити на ґрунт, що містить скло. Інша можливість збільшення швидкості диференціації гемопоетичних стовбурових клітин може бути досягнута шляхом диференціації морфологічно недиференційованих клітин, що містяться в супернатантах середовища. На питання про те, чи не приєднуються клітини будуть диференціювати ендотеліально, слід відповісти, замінивши ці клітини. Іншими джерелами ендотеліальних клітин є CD14 позитивні, моноцитарні стовбурові клітини (Fernandez et al., 2000) та MNC (Murasawa et al., 2002). Їх слід ізолювати від лейкаферезу, пухких шарів та кісткового мозку. Дослідження повинні бути обмежені кількісною оцінкою отриманих ендотеліальних клітин та їх імуногістохімічною характеристикою. Усі три типи клітин та свіжоізольовані гемопоетичні стовбурові клітини слід порівнювати між собою з огляду на їх диференційовану поведінку.

24 24 C Матеріал та методи 1 Матеріал 1.1 Лабораторне обладнання Таблиця 1: Лабораторне обладнання, що використовується Джерело постачання Назва виробника Бренд пристрою, лічильна камера Вертхайма Нойбауера Лічильна камера Eppendorf, Гамбург Довідкові 10, 100 та 1000 піпеток Forma Scientific, Marietta (США) Інкубатор водяних сорочок Лабораторна технологія водяної ванни GFL, Burgwedel Heraeus Instruments, Hanau Lamin Air HB 2448 Varifuge 3.2 RS стерильний робочий стіл центрифуга Hirschmann лабораторне обладнання, батарея Pipetus, допоміжний пристрій для піпетування Heilbronn Leica, Solms LEICA DM IRB з флуоресцентним програмним забезпеченням IM50 Мікроскоп зворотний Miltenyi Biotecgmag MigtengeiMog., Франкфуртська цитоспін 2 цитоцентрифуга Zeiss, Jena Axioplan Axiovert 25 Phomi 3 флуоресцентний інвертований мікроскоп інвертований мікроскоп/флуоресцентний інвертований мікроскопний мікроскоп

25 Витратні матеріали Таблиця 2: Витратні матеріали Джерело постачання Becton Dickinson, Franklin Витратні матеріали Discardit II Стерильні шприци; 5, 10 і 20 мл озер (США) BD Falcon, Гейдельберг Стерильні одноразові піпетки; 1, 2, 5, 10 і 25 мл планшетів для лунки культури клітин; Сита для багатоклітинних 6, 12, 24 або 96 лунок з клітинними ситами, 40 мкм, центрифужні пробірки; 15 і 50 мл Greiner, Frickenhausen Eppendorf, Hamburg Heinz Herenz, Hamburg Millipore, Schwalbach Miltenyi Biotec, Bergisch Tubs: 15 і 50 мл реакційні посудини; 0,5 і 1,5 та 2,0 мл пастерові піпетки 230 мм, скло Стерифліп (одноразова стерилізаційна установка) MACS Розділювальні колонки LS та MS Gladbach Partec, Münster Paul Marienfeld GmbH & 30 мкм сито для клітин покривають окуляри Co.KG, Königshofen Lauda slide Sarstedt, Наконечники піпеток Нюмбрехта (10, 100 та 1000 мкл) Schott, Mainz Shandon Inc., Пітсбург (США) Скляні паперові фільтри для Cytospin 2 (фільтруючі картки товсті) VWR International, стерильні шприцеві фільтри 0,45 та 0,22 мкм (стерильний діетикон (Швейцарія) шприцевий фільтр)

26 Хімічні та медичні вироби Таблиця 3: Хімічні вироби та медичні вироби, що використовуються Джерело постачання Baxter, Munich Biochrom AG, Berlin Biotest, Dreieich Хімічний/медичний продукт ACD-A Biocoll Separating Solution (Ficoll) AB-Serum Human Serum Albumin (HSA) Cambrex, New Jersey (USA) EGM-2 Bullet Kit Fährhaus Handelsgesellschaft Hamburg Gibco, Karlsruhe Pharma mbh, гідрокортизон (HC) D-PBS Фетальна теляча сироватка (FKS) Фунгізон (Амфотерицин B) Кінська сироватка (HS) IMDM Penicillin-Streptomycin-Glutamine (EDTA) ) Harbor Bio-Products, Фібронектин людини (FN) Норвуд (США) JT Baker, Phillipsburg Ethanol Absolute (США) Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach CD133 Комплект ізоляції клітин, людський CD14 Micro Beads, людський MACS BSA Stock Solution R&D Systems, Міннеаполіс (США) rhang-1 (Recombinant Human Angiopoietin-1) rhang-2 (Recombinant) Людський ангіопоетин-2) Трипан-блакитний розчин (0,4%) TEBU, Offenbach bfgf (основний фактор росту фібробластів) EGF (епідермальний фактор росту) Flt-3-ліганд (Flt-3-l, пов'язана з Fms тирозинкіназа 3 ліганд)

27 27 HGF (фактор росту гепатоцитів людини) IGF-1 (інсуліноподібний фактор росту-I) IL-8 (інтерлейкін-8 або хемотаксичний фактор нейтрофілів, одержуваний моноцитами) SCF (фактор стовбурових клітин) SCGF-ß (фактор росту стовбурових клітин -бета) VEGF (судинний фактор росту ендотелію або рекомбінат людини VEGF165) 1.4 Антитіла для імунофлуоресцентного аналізу Таблиця 4: Використані антитіла Маркування людини Ізотип Клон Застосування Джерело постачання Антиген g CD144 - Миша 55-7H1 Імун-BD Pharmingen, (VE- IgG 1 κ гістохімія Сан-Дієго (США) Cadherin) FITC vwf (von- Sheep- - Immun- The Binding Site, Willebrand Anti- histochemistry Birmingham -factor) Людина (Великобританія) IgG Secondary Texas Red Goat- - Immun- Jackson Antibodies Anti- histochemistry ImmunoResearch, для CD144 Mouse West Grove IgG (США) (H + L)

28 Склад використовуваних буферів та середовищ Цитокіни та їх концентрації Таблиця 5: Огляд використовуваних факторів та їх концентрацій Фактори Концентрація в отриманому вихідному розчині (мкг/мл) (нг/мл) bfgf 50 1 EGF Flt-3-l HGF IGF IL rhang-1 (Ang-1) rhang-2 (Ang-2) SCF SCGF-ß VEGF концентрація основного середовища та буфери AB-PBS -8 мл PBS -2 мл AB-сироватковий ерилізний буфер (стерильний відфільтрований) -8,29 г NH4Cl (155 мм) -1 г KHCO3 (10 мм) -45,2 мг ЕДТА (0,1 мМ) -1 л H20 EBM мл EGM-2 базальне середовище -10 мл FCS -1 мл пеніциліну/стрептоміцину (Pen/Strep) -100 мкл амфотерицину B.

29 29 EBM-1-80 мл EGM-2 базальне середовище -20 мл FCS -1мл пеніцилін/стрептоміцин (Pen/Strep) -100 мкл амфотерицину B EBM-2-450mL EGM-2 базальне середовище -50 мл FCS -5 мл пеніцилін/стрептоміцин -2 мл rhfgf-бхепарин -500 мкл амфотерицину B -500 мкл GA-1000 (гентаміцин) -500 мкл аскорбінової кислоти (AS) -500 мкл VEGF -500 мкл R3-IGF мкл гепарину -500 мкл регф-200 мкл гідрокорт EMON; стерильний відфільтрований) -50 мл LBMCM (Довготривале культуральне середовище кісткового мозку. Dexter TM; Acta Haematol. 1979; 62 (5-6):) -500 мкл SCGF-ß (10 мкг/мл) -250 мкл VEGF (10 мкг/мл) -250 мкл Flt3-l (10 мкг/мл) основного розчину фібронектину (для покриття пластин): -1 мг фібронектину (FN) -1 мл стерильної води -24 мл PBS MACS-буфер -475 мл PBS -12,5 мл людського сироваткового альбуміну (HSA) -3 мл аквацитрату декстрози A (ACD-A) стоп-середовище (після трипсинізації) для ендотеліальних клітин: 20% FCS в базальному середовищі EGM-2 або в супер середовищі

30 30 LBMCM -400 мл IMDM -50 мл Фетальна теляча сироватка (FKS) -50 мл Кінська сироватка (HS) -500 мкл Гідрокортизон (HC) Трипсин основний розчин: -1 мл Трипсин -9 мл PBS основне середовище з додаванням цитокінів як диференціюючого середовища -LBMCM як базове середовище Таблиця 6: Огляд доданих цитокінів Додані цитокіни VEGF VEGF + Ang-2 VEGF + bfgf VEGF + EGF VEGF + HGF VEGF + IGF-1 VEGF + IL-8 VEGF + bfgf + EGF VEGF + bfgf + HGF VEGF + bfgf + IGF-1 VEGF + bfgf + IL-8 VEGF + bfgf + Ang-2 VEGF + bfgf + EGF + HGF + IGF-1 + IL-8 - EBM-1 як базове середовище Таблиця 7: Огляд використовуваного Фактори та їх комбінації Додані цитокіни VEGF VEGF + Ang-1 VEGF + Ang-2