Ознайомлення з використовуваними техніками; в біохімії
Антитіло (Ab) - це білок, що виробляється імунною системою, який може зв’язуватися з певною молекулою, як правило, білком, своїм антигеном (Ag). Дуже висока специфічність розпізнавання Ag за допомогою Ab та стабільність взаємодії Ag-Ab зробили те, що методи, отримані з імунології, використовувались навіть для досліджень, які не мають нічого спільного з дослідженнями.
Антитіла - це білки сімейства імуноглобулінів (Ig). В організмі існує кілька типів Ig (IgA, IgG, IgM та ін.). У біохімічних цілях ми в основному використовуємо IgG, антитіла, які можуть зв’язуватися з двома антигенами. Значно рідше використовувані, але маючи цікавий потенціал розвитку, IgY виробляються птахами, включаючи курей, і містяться в яйцях, усуваючи необхідність у зразках крові.
Для більш поглибленого обговорення структури антитіл можна звернутися до хорошого підручника з імунології. Також доступна проста, але відносно повна презентація цієї інформації Д. Вілкінсона
МЕТОДИ ТА АПАРАТ
В даний час антитіла зазвичай отримують у комерційних постачальників. У деяких випадках вам доводиться виробляти антитіла самостійно, особливо якщо ви працюєте з рідкісними або нещодавно виявленими білками. По-перше, тварин потрібно імунізувати, щоб змусити їх виробляти антитіла проти білка, над яким ви працюєте. Можна приготувати поліклональні або моноклональні антитіла. З цього сирого препарату часто доводиться переходити до очищення антитіла.
Якість препарату антитіла для аналізу або ідентифікації залежить від двох основних факторів, специфічності та авідності (або спорідненості). Перш за все, антитіло повинно реагувати лише на цікавий білок, щоб уникнути перехресних реакцій з іншими білками, які можуть його забруднити, це специфіка. З іншого боку, він повинен сильно реагувати з цим білком і мати велику спорідненість до нього, це жадібність.
Імунізація тварин
Деякі види особливо використовуються для отримання антитіл: кролики, миші, щури, кози, вівці та коні. Вибір тварини ґрунтується на різних критеріях. Якщо вам доводиться виробляти багато антисироватки, тоді ви вибираєте тварину більшого розміру. однак великі тварини дорожчі (закупівля, розведення тощо) і часто з ними легше поводитися. З іншого боку, якщо ми хочемо тварину, з якою легко працювати і розводитись у лабораторії, ми звернемося до менших видів. Маленьких тварин, таких як щури або миші, легко утримувати в недорогих приміщеннях і ними легко користуватися. Однак не можна брати велику кількість крові. Тому часто використовуються види проміжних розмірів, такі як кролик. Кількість доступного антигену також є дуже важливим фактором: чим більша тварина, тим більше антигену потрібно, щоб викликати корисну імунну відповідь.
У будь-якому випадку, важливо вибрати тварину, яка є філогенетично якомога далі від джерела білка, яким потрібно імунізувати. Дійсно, білок є тим більш антигенним, оскільки він не нагадує білок, який зазвичай присутній у виду, якого потрібно імунізувати. Таким чином, якщо хтось бажає приготувати антитіло проти щурячого білка, він часто віддає перевагу імунізації коня чи кози, а не іншого гризуна, такого як миша. Однак, як уже згадувалося раніше, обмеження, притаманні використанню великих тварин, все ще можуть стимулювати перехід до менш придатного виду, який легше розводити та обробляти. Очевидно також, що не можна імунізувати тварину проти білка, загального для тварин її власного виду! Мишей особливо використовують для виробництва моноклональних антитіл.
Антиген можна вводити кількома способами, найголовніше, щоб антиген залишався в організмі якомога довше і потроху потрапляв у кров, щоб максимізувати вироблення антитіл. Основними шляхами введення є підшкірні, внутрішньошкірні або внутрішньом’язові ін’єкції; внутрішньовенні та внутрішньочеревні ін’єкції застосовуються лише в особливих випадках. Щоб уповільнити вивільнення антигену в кров і активізувати імунну відповідь, антиген зазвичай поєднують з емульсією, яка називається ад'ювантом. Найвідомішим є, безсумнівно, ад'ювант Фрейнда, який складається з мінеральної олії, доданої до емульгуючого агента (неповний ад'ювант), і частинок інактивованої палички туберкульозу (повний ад'ювант). Однак цей тип процедур, котрі вживають кометів, є болючим для тварин і настійно не рекомендується агентствам з питань захисту тварин. Інші продукти рідше використовуються, такі як солі галуна, метильований сироватковий яловичий альбумін тощо.
Імунна система відносно легко виробляє антитіла проти великих молекул, таких як білки та полісахариди, ці молекули називаються імуногенами. Однак малі молекули (наприклад, стероїдні гормони, малі пептиди тощо) мають дуже низьку антигенність. Однак антитіла можуть вироблятися проти невеликих молекул, які потім називаються "гаптенами". Перш за все необхідно кон’югувати ці малі молекули на векторах («носіях»), таких білках, як альбумін або гемоціанін лімп (різновид безхребетних). Після введення цього комплексу тварині індукує утворення антитіл проти гаптену як такого та переносника. Після звільнення антитіл проти власного гаптену тих, хто розпізнає вектор, ці антигаптени можна використовувати. Ось як ми можемо приготувати антитіла проти певних гормонів, ліків або малих пептидів.
Сироватка, що містить бажане антитіло, називається антисироваткою. Зазвичай він містить кілька видів різних антитіл (близько десяти клонотипів), спрямованих проти кількох епітопів (детермінант або ділянок зв'язування) одного і того ж антигену, так називається цей поліклональний препарат. З такою сумішшю одна і та ж молекула антигену може зв’язувати кілька різних антитіл одночасно, кожне зі своїм специфічним епітопом. Були розроблені методи виділення та клонування лімфоцитів, які продукують лише один молекулярний вид (тобто клонотип) антитіл, ці антитіла називаються моноклональними. Ці антитіла розпізнають лише один епітоп антигену.
Отримання поліклональних антитіл
Поліклональна суміш містить кілька антитіл, що розпізнають кілька різних епітопів одного і того ж антигену. Це робиться шляхом введення білка, що цікавить, тваринам обраного виду. Первинна реакція слідує за активацією Т-клітин після першого впливу антигену. Зазвичай він тривалий, один-два тижні, і низької інтенсивності. Щоб збільшити вироблення антитіл, ми проводимо інші ін’єкції, підсилювачі. Тоді вторинна відповідь буде результатом дії лімфоцитів групи B. Це буде тоді більш інтенсивно і швидше. Ми можемо зробити кілька підсилювачів, щоб стимулювати вироблення антитіл або, якщо потрібно, відновити його.
Антиген рідко вводять самостійно. Зазвичай його поєднують із сумішшю, ад'ювантом, яка виконує роль стимулювання антигенної відповіді.
У цієї тварини забирають сироватку після того, як вона встигла продукувати достатню кількість антитіл. Сироватка, яка в основному містить бажане антитіло, часто називають антисироваткою. Очевидно, що ця антисироватка, крім того, що є поліклональною, є універсальною. Він містить антитіла проти всіх чужорідних білків (вірусних, бактеріальних), яким тварина зазнавала більш-менш нещодавно. Тоді часто стає необхідним очистити антитіло, яке нас цікавить.
Ця техніка порівняно недорога. Однак специфічність антитіла не обов'язково дуже сильна. Щоб цей препарат не давав перехресних реакцій, антитіло повинно бути очищене. Крім того, для збільшення специфічності важливо, щоб вводиться антиген був якомога чистішим.
Приготування моноклональних антитіл
Препарат моноклонального антитіла містить один вид антитіла (клонотип), який розпізнає лише один епітоп антигену. Для отримання такого препарату антиген спочатку вводять миші. Через кілька днів селезінка буде містити велику кількість В-клітин, що продукують різні клонотипи. В-лімфоцити не можуть розмножуватися в культурах клітин in vitro. Ці В-лімфоцити з селезінки все ще можуть бути виділені та злитися з клітинами мієломи, які є трансформованими клітинами, отже, безсмертні лінії, які можна необмежено підтримувати в культурі. Клітини, отримані в результаті цього злиття, часто називають гібридомами.
Використовувані штами мієломи повинні бути мутантами, які не мають ні тимідинкінази (TKase), ні HGPRTase, двох ферментів, необхідних для біосинтезу. de novo нуклеотиди. Ці клітини можуть рости і розмножуватися, лише виробляючи нуклеотиди через метаболічні шляхи для відновлення нуклеотидів. Ці шляхи інгібуються антагоністами фолієвої кислоти, такими як аміноптерин. Ці мутантні мієломи гинуть у середовищі, що містить аміноптерин або будь-який антагоніст фолієвої кислоти, оскільки вони не здатні біосинтезувати нуклеотиди. Дійсно, аміноптерин блокує біосинтез нуклеотидів через метаболічні шляхи відновлення ("шляхи відшкодування"), і мутація перешкоджає функціонуванню шляхів. de novo. Середовище також містить тимідин та гіпоксантин, дві азотисті основи, які є вихідними точками шляхів відновлення.
Результат злиття дасть суміш, що містить три типи клітин. По-перше, є не злиті клітини селезінки, які виробляють антитіла, але які не здатні рости in vitro. Потім є трансформовані не злиті клітини, які здатні розмножуватися, але інгібуються аміноптерином. Нарешті, існують гібридоми, клітини, що є результатом злиття трансформованих клітин і лімфоцитів. Гібридоми здатні розмножуватися нескінченно довго, оскільки мають геном трансформованих клітин. Крім того, оскільки вони також мають геном лімфоцитів, гібридоми здатні біосинтезувати нуклеотиди шляхом відновлення, використовуючи тимін та гіпоксантин із середовища. Тож лише гібридоми зможуть як розмножуватися в цьому середовищі, так і виробляти антитіла. Очевидно, що більшість гібридом не продукували бажаних антитіл, їх потім потрібно пройти скринінг для їх виділення та клонування.
Для виділення клонів, що продукують лише один вид антитіл, застосовували техніку граничних розведень. Гібридоми розводяться до дуже низької концентрації. Культури готуються з дуже малими обсягами. Обмежувальне розведення означає, що шанс цього дуже маленького об'єму, що містить дві клітини, надзвичайно низький. Тому майже напевно, що клітини, отримані в кожній культурі, походять лише з однієї початкової клітини; отже, це чисті клони. очевидно, що продукується лише один клонотип антитіла. Потім можна ідентифікувати клони, що продукують відповідне антитіло. Обмежувальне розведення можна повторити на клонотипах, щоб переконатися, що клітинна лінія справді чиста. Вихід цього методу, очевидно, дуже низький, і дуже мала частка гібридом продукує клонотип проти антигену.
Потім ці клони повинні бути об’єктом масивних культур для утворення достатньої кількості антитіл. Навіть незважаючи на те, що ці масивні культури можна проводити in vitro, проте вони частіше проводяться in vivo. Для цього ці клітини вводять у черевце інших мишей, де вони будуть розмножуватися у вигляді асциту. Ці асцити будуть виділяти антитіла в порожнині очеревини цих мишей, які потім можна відновити, видаливши асцитичну рідину.
Ці методи дуже дорогі з точки зору установок, реагентів, часу та праці. Однак отримані антитіла надзвичайно специфічні. Однак, оскільки ця специфічність залежить лише від окремого епітопу, моноклональні антитіла також міцно зв'язуються з будь-яким забруднюючим білком, "випадково" що містить цей епітоп. Крім того, імунохімічні методи, що вимагають утворення преципітину або великих комплексів антитіло-антиген, не можуть застосовуватися з моноклональними антитілами.
Очищення антитіл
Залежно від передбачуваного використання застосовуватимуться більш-менш очищені препарати антитіл. Для деяких застосувань потрібна лише антисироватка, для інших потрібні чисті антитіла, але більшість із них вимагатимуть між цими двома крайностями.
Найчастіше застосовується техніка очищення - афінна хроматографія. Але, по-перше, можна приступити до сирого відділення Ig від інших білків сироватки крові (альбумін, трансферин тощо) шляхом диференціального осадження сульфатом амонію. Іонообмінна хроматографія також можлива, хоча і менш широко застосовується.
Все частіше афінну хроматографію проводять з білком А або білком G як лігандом для константної області антитіл (Fc). Це білки з бактеріальних джерел, здатні зв'язуватися з Fc-ділянкою антитіл. Нещодавно виявлений білок, L-білок, що зв'язується з k-ланцюгами певних класів антитіл, набирає популярності.
Потім для очищення специфічного антитіла може бути проведена афінна хроматографія з антигеном як лігандом. Тільки антитіло проти цього білка повинно прикріплюватися до колонки, а всі інші білки сироватки відмиваються в елюаті. Можна також використовувати "штучні пептиди", що нагадують певні особливо антигенні епітопи антигену (пептидомиметичні ліганди).
Залишається лише десорбувати антитіло, яке на даний момент є практично чистим.
Звичайні колонки для хроматографії також перебувають у процесі заміни намагніченими смоляними кульками, до яких прив’язаний обраний ліганд. Великою перевагою такого підходу є швидкість розділення. Замість того, щоб дозволяти різним буферам просочуватися крізь колону, намагнічені кульки (і те, що з ними пов’язано) можна легко зібрати магнітом.
створення: 98 04 10
доповнення: 00 07 14
ЛІТЕРАТУРА І БІБЛІОГРАФІЯ
С. Бейлі (1984a) Виробництво антисироватки в методах молекулярної біології (частина 2) (Дж. М. Уокер, ред.), Pp 295-300, Humana Press, Clifton (США).
T Chard, (1978) Вступ до радіоімуноаналізу та суміжних методів, Паб Північної Голландії. Co., Амстердам.
RL Сушарка, Г. Ф. Лата (1989) експериментальна біохімія, Oxford Univesity Press, Oxford, p. 217-33. [загальний огляд щодо використання антитіл у біохімії, лікування структури антитіл, способів одержання та очищення поліклональних антитіл]
П Камун (1987) Апарати та методи в біохімії, Flammarion, 3-е видання, Médecine-Sciences, Париж. С. 221-6
Д.Т. Пламмер (1987) Вступ до практичної біохімії (3-е видання), McGraw Hill Book Co., Лондон. [108-111]
П. Тейссен (1985) Практика та теорія імуноферментних аналізів, Elsevier, Амстердам. с.39-78. [детальне обговорення препарату антитіл та теорії, що лежить за ним]
К Сікора (1983) Кому потрібні моноклонали Nature 304: 97.
S Vora (1985) Моноклональні антитіла при дослідженні ферментів: сучасне та потенційне застосування, Anal Biochem. 144: 307-18.
Доктор Вілкінсон (2000) Імунохімічні методи надихають на розробку нових методів очищення антитіл, Вчений 14:25. [популярна стаття про нові методики очищення антитіл (G, A, L білки, магнітні кульки, пептидо-міметичні ліганди тощо), включаючи опис структури антитіл]