Покоління химерних мишей з мутаціями в сигнальному домені CD22 і
Покоління химерних мишей з мутаціями в сигнальному домені CD22 та дослідження функції CD22 у нокаутованих мишей Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора баварського Університету Юлія Максиміліана в Вюрцбурзі, представлена Клаусом-Пітером Данцером з Мангейма-Некарау Вюрцбург, 2002
Представлено: Члени докторської комісії: Голова: Рецензент: Доктор вип. нац. хабіл. Ларс Ніцке Рецензент: проф. вип. нац. Герт Пфлюгфельдер День докторського колоквіуму: Докторський сертифікат виданий:
Пояснення: Цим я заявляю, що написав дисертацію «Побудова химерних мишей з мутаціями в області сигналізації CD22» та дослідження функції CD22 у мишей-нокаутів, і що я не використовував жодних інструментів чи джерел, крім зазначених мною. Я також заявляю, що ця дисертація не була подана в жодній іншій процедурі експертизи, ні в тій же, ні в іншій формі. Окрім ступенів, задокументованих заявою про вступ, я раніше не здобував та не намагався отримати будь-які подальші вчені ступені. Вюрцбург, Клаус-Пітер Данцер
Ця робота проводилась в період з 15 січня 1998 року по 31 січня 2002 року в Інституті вірусології та імунобіології Баварського університету Юлія Максиміліана Вюрцбурга під керівництвом доктора. вип. нац. хабіл. Ларс Нічке зробив.
IV 7.2 Список публікацій. 111 7.2.1 Оригінальні тези з цієї докторської дисертації. 111 7.2.2 Публікації на конгресах/конференціях. 111 8. Додаток. 113 8.1 Скорочення. 113 8.2 Послідовності праймерів. 115 8.3 Векторні карти. 117 9. CV. 120
13 відсік. Тому були підстави підозрювати, що кількість клітин MZ B у мишей CD22 -/- може бути зменшена. Тому слід дослідити розмір B-клітинного компартменту у мишей CD22 -/- та наслідки можливого зниження реакції на антигени TI-2.: α2,6-сіалова кислота CD22-ITIM- KO CD22-безхвоста Syk SOS? Grb-2 P Y- P Y- P Y- -F ITIM SHC Grb-2 SHIP Lyn PI3K PLCγ2 -F ITIM -F ITIM SH2 SH2 PTPase SHP-1 Рис. 3: Дві заплановані моделі миші для вивчення передачі сигналу CD22 in vivo . Ліва сторона: CD22-ITIM-KO: Тирозини в ITIM мутували до фенілаланінів. Очікується, що інгібуючий сигнал білок тирозинфосфатаза SHP-1 більше не може взаємодіяти з CD22 і, отже, може активуватися. Навпаки, зв'язування позитивних модуляторів сигналів B-клітин PLCγ, Lyn, PI3K та Grb-2 все ще буде можливим. Також можна пов’язати SHIP як частину комплексу SHIP-Grb2-Shc. Права сторона: CD22-безхвостий: стоп-кодон в екзоні 12 веде до експресії молекули CD22 без цитоплазматичного домену. Ця модель миші доповнить CD22-ITIM-KO. Обидві моделі також слугуватимуть для з'ясування зв'язку між передачею сигналу та адгезійною функцією CD22.
14 2.1 Матеріали 2. Матеріали та методи 2.1.1 Штами бактерій E.coliNM522: (F`lacIq (lacz) m15 proa + prob + (hsdms-mrcb) 5 (lac-proab) супе thi-1 лямбда) спочатку служив штамом клонування E. .coliDH5α: F-delta (laczya-argf) u169 phi80delta (lacz) m15 enda1 reca1 hsdr17 deor thi-1 supe44 gyra96 rela1 rpsl lambda- був використаний як стандартний штам клонування в пізнішому курсі даної докторської дисертації E. coliBNN1321 enda sup96: sua196 supe196: sua1: sua1: enda delta (lac-proab) (F trad36 proa + prob + laciq delta (lacz) m15) lambdakc (kan-cre) був використаний для перевірки функціональності послідовностей loxp у використовуваних конструкціях націлювання. E. coliJM110: F [trad36 proa + prob + laciq delta (lacz) m15] dam dcm supe44 hsdr17 thi leu thr rpsl lacy galk was ara tona tsx delta (lac-proab) lambda був використаний як штам-хазяїн для плазмід, які розрізали з рестрикцією, чутливою до метилуля має бути. 2.1.2 Хімічні речовини Якщо не вказано інше, лабораторні хімічні речовини були від Roth (Karlsruhe) або Merck (Darmstadt) 2.1.3 Буфери та розчини, що використовуються багаторазово ТЕ-буфер 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ EDTA, pH 8,0 PBS (фосфатно-забуференний Фізрозчин) 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na 2 HPO 4, 0,24 г KH 2 PO 4, 0,133 г CaCl 2 2H 2 O, 0,1 г MgCl 2 6H 2 O з HCl ph7.2 FACS-буфер 1 x PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN 3
36 loxp loxp pcd22-itim-ko tk neo 1112 13 14 15 цільовий геном. Locus loxp loxp tk neo рекомбінований Locus Cre видалення loxp rec./ cre-delet. Локус-екзон 11-15 мутував ITIM (Y F) 1 kb Рис. 6: Перебіг гомологічної рекомбінації вектора pcd22-itim-ko з ендогенним CD22-локусом. Подальше видалення селекційної касети з Cre-рекомбіназою залишає лише змінені ITIM в екзонах 13 і 15 та послідовність loxp в інтроні 14/15 як зміни.
43 neo-зонд pcd22-3bs-hindiii зонд EBEBE 1112 13 14 15 9,5 kb WT EcoRI фрагмент ген. Locus EB 11 kb WT BamHI фрагмент B, націлений на EBE tk neo B loxp loxp EB рекомбінований локус EE 9,5 kb рекомбінований 3 kb рекомбінований EB 9 kb рекомбінований B 6 kb рекомбінований B exon 11-15 мутація (стоп-кодон) Рис. 11: CD22 локус дикого типу та локус, рекомбінований з pcd22-ex12-stop з місцями розщеплення ферментів рестрикції BamHI (B) та EcoRI (E. ). Наведені фрагменти дають результат після перетравлення за допомогою EcoRI або BamHI. Зміни до фрагментів рестрикції дикого типу (WT) виникають під час рекомбінації через інтерфейси EcoRI в неокасеті або через інтерфейс BamHI у праймерах мутагенезу.
44 a) 11kb wt/wt wt/безхвостий M12.2.3 M12.4.1 b) 9.5kb wt/wt wt/tailless M12.2.3 M12.4.1 9.5kb 9kb 6kb 3kb травлення: зонд BamHI: pcd22-3bs-hiii травлення: Зонд EcoRI: pcd22-3bs-hiii в) вага/безхвоста вага/вага M12.2.3 M12.4.1 перетравлення 9 кб: зонд BamHI: neo Рис. 12: Південні плями правильно рекомбінованих клонів клітин ES CD22-безхвостих M12 .2.3 та M12.4.1, кожен з яких представлений контрольним клоном дикого типу (мас./Мас.). Схематичне зображення локусу дикого типу та рекомбінованого локусу, фрагментів, що є результатом перетравлення за допомогою EcoRI або бамхі, та зондів, див. Рисунок 11. а) Геномна ДНК CD22-ITIM-KO клонів CD22-ITIM-KO, визначених як позитивні перетравлюється BamHI. Перетравлення BamHI локусу дикого типу призводить до фрагменту рестрикції 11 кб. Інтеграція конструкції pcd22-itim-ko у локус дикого типу збільшує це
45 фрагмент на 14 кб. Pcd22-3bs HindIII та зонд всередині неокасети знову використовувались як зонд. Рисунок 13. pcd22-3bs-hindiii-sonde neo-sonde BBB 1112 13 14 15 11 kb WT BamHI фрагмент B ген. Локусне націлювання рекомбінованого локусу B loxp tk дає огляд фрагментів, що утворюються при перетравленні BamHI, та використаний зонд neo loxp BB 14 кб рекомб. Фрагмент BamHI B, екзон 11-15, мутував ITIM (Y F) 1 kb Рис. 13: Локус CD22 дикого типу та локус, рекомбінований з pcd22-itim-ko з місцями розщеплення ферменту рестрикції BamHI (B). Наведені фрагменти виникають після перетравлення за допомогою BamHI. Завдяки інтеграції касети neo/tk, рекомбінований локус збільшується на 3 кб порівняно з локусом дикого типу. Як приклад, на фіг.14 показано Саузерн-блот клонів CD22-ITIM-KO YFtar3F1 та YFtar10E3. Плямки показали, що YFtar3F1 та YFtar4E6 не мають додаткових інтеграцій. Однак для YFtar10E3 в геномі була знайдена інша копія конструкції (не показано).
57 pcd22-itim-ko loxp loxp 1 kb tk neo 1112 13 14 15 1) Пошук геномної послідовності 2) Розробка стратегії клонування 3) ПЛР-клонування 4) Секвенування 5) Видалення HSV-tk loxp loxp neo 8 9 10 1112 13 14 15 129/ola pcd22-itim-ko-ext-tk exon 8-15 мутовані ITIM (YF) Рис. 17: Збільшити частоту гомологічної рекомбінації вектора C57BL/6 pcd22-ITIM-KO у неізогенних 129-ES клітинних ліній, вектор подовжували за допомогою PCR-ампліфікованого шматочка ДНК E14Tg2a. Обов’язковою умовою був пошук майже повної послідовності миші CD22 при пошуку в базі даних. Експеримент з націлюванням був проведений у лінії клітин ES WW6 з проміжним етапом двох векторів pcd22-itim-ko-ext (не показано), показаних на малюнку (див. Текст).
58 Конструювання безхвостого (03/99) ITIM-KO (11/99) Безхвостого (05/00) ITIM-KO (05/00) ITIM KO (06/00) ES клітинна лінія Кількість клонованих екранованих ПЛР-позитивних репродукцій ПЛР. C57BL/6-III 300 8-4 C57BL/6-III 500 5 3 3 C57BL/6-III 200 3 2 2 C57BL/6-III 150 2 2 2 Southern Blot C57BL/6-III 400 0 - - - змінені умови культури: Нове середовище, циферблат PBS, Pen/Strep, Gln, β-me ITIM-KO (08/00) відповідно до PCR-Optim. Безхвостий циферблат (08/00) згідно з методом PCR-Optim. ITIM-KO (11/00) Безхвостий (11/00) ITIM-KO (02/01) Безхвостий (07/01) BALB/cI 600 0 - - - 150 1 0 - - BALB/cI 600 1 0 - - 600 7 0 - - C57BL/6-III 500 6 2 - C57BL/6-III 400 12 11 - E14Tg2a 500 2 0 - - E14Tg2a 650 2 0 - - Des. M12 2.1, 2.3, 4.1, 4.2 YFtar3F1, 4E6, 10E3 M12 8D1, 10D5 YFtar12B5, 12A4 YFtar29D2, 30F1 M12 15F5, 17B3,17B7, 17C7,18A3, 18B5,19A1, 19F2,21C4, 21E5d2c2 -itim-ko pcd22-itim-ko-ext-tk, використовуйте ESGRO ITIM-KO (10/01) WW6 400 0 - - - ITIM-KO E14Tg2a 960 0 - - - Таблиця 1: Огляд усіх експериментів з націлюванням генів цієї докторської дисертації та отримані гомологічно рекомбіновані клони
59 місяців/рік інжектор для проходження клонів молоде спарювання 05/00 M12 2,3 M12 4,1 приблизно P 30 приблизно P 30 06/00 YFtar3F1 приблизно P 21 09/00 M12 10D5 приблизно P 17 09/00 YFtar12B5 приблизно P 17 YFtar3F1Cre C/B2 приблизно P 32 B. Ledermann B. Ledermann B. Ledermann B. Ledermann none - none - none - 2 химери B. Kneitz none - з BL/6, відсутність передачі зародкової лінії 12/00 12/00 01/01 03/01 03/01 04/01 05/01 07/01 08/01 YFtar3F1Cre C/B4 YFtar3F1Cre C/B2 YFtar3F1Cre C/B4 YFtar3F1Cre C/B2, C/B4 YFtar3F1Cre B1 YFtar12B5 Cre S2F4, S2B5 YFtar S2C12 S1C8 YFtar12B5 Cre S1F7, S2F7 YFtar12B5 Cre S1A1, S3A7, S3D8 YFtar12B5 CreS3B8 приблизно P 32 B. Кнайц 8 хлопчиків, 4 з них химерні приблизно P 32 B. немає - приблизно P 32 Ледерманн жоден - приблизно P 34 B. Kneitz 2 померлих, 6 померлих - приблизно P 32 приблизно P 26 приблизно P 26 B. Кнейц Б. Кнейц Б. Ледерманн 5 хлопчиків, 1 з них химерний 7, 1 високохимерний (помер) жоден - приблизно P 27 B Кнейц - приблизно P 27 B Кнайца немає - приблизно P 28 B. Кнейца немає - з BL/6, відсутність зародкової лінії з BL/6, відсутність зародкової лінії n - Таблиця 2: Огляд усіх ін'єкцій бластоцисти, здійснених під час цієї докторської дисертації гомологічно рекомбінованих та повністю охарактеризованих клонів ES клітин
63 вектор pcd22-itim-ko щодо перерваного зв'язку SHP-1 дуже ймовірно. 149 39 35 CD22-ITIM-KO 4A1 147 53 48 CD22-ITIM-KO 6D4 140 48 35 CD22-wt Ib.D4 148 37 41 CD22-wt Vb.C3 4 6 Контрольний IgM CD22 a2,6-sia Рис. 18: Поверхнева експресія CD22 та a2,6-сіалової кислоти на клонах J558L-CD22-wt та J558L-CD22-ITIM-KO, відібраних для дослідження фосфорилювання тирозину та асоціації SHP-1 CD22. Вираз поверхневих маркерів показано у вигляді гістограми, MFI - для кожної гістограми.
68 Вт CD22 -/- 55,5 89,5 10,5 6,5 95,5 58,7 4,5 2,8 43 67 20,9 33 59,5 92,1 7,9 5,1 B220 + Сіалідаза NeuGc-SA 63,5