Природи - їх легко розпорошити вітром, водою, тваринами, машинами, документом PDF
Документи
ІДЕНТИФІКАЦІЯ СТУПЕНЮ ОПІРНОСТІ ВОЛКУ (РАСА Е)
У ЯКИХ ГЕНОТИПАХ СОНЯШНИКА
Марія ДУКА, Аліона ГЛІДЖІН, Вікторія ПОПЕСКУ
Кафедра біології рослин Молекулярні маркери, пов'язані з генами стійкості до бронмупера, дозволять краще зрозуміти генетичний детермінізм
стійкість до соняшнику і сприяти ранньому відбору шляхом скринінгу присутності кількох специфічних ДНК-маркерів. Ми провели аналіз 29 соняшникових ліній із маркером SCAR RTS05, пов’язаним з локусом соняшнику Or5 con-
опірність стійкості до мітли, яка належить до раси E. Ідентифікація амплікону 650 п.н. у 27 генотипів виявляє наявність гена Or5, відсутнього в цьому ампліфікованому продукті
у Ксенії ♀ та цитоплазматичного чоловічого стерильного генотипу №7 припускають сприйнятливість до раси E. Вступ Лупоая є голопаразитом покритонасінних рослин, який паразитує на коренях сільськогосподарських культур, як квітка-
сонце, помідори, тютюн, квасоля та інші [1]. Соняшник атакується видом Orobanche cumana Wallr., Що спричиняє серйозні втрати плодів у східноєвропейських та середземноморських країнах [2]. На сьогоднішній день виявлено п’ять фізіологічних штамів Оробанче (A-E), що мають різне географічне [2,3] та генетичне [4] походження. Таким чином, стійкість до раси А визначається геном Or; стійкість до раси B - гена Or2, який також надає стійкість до раси A; стійкість до раси C визначається геном Or3, який надає стійкість до рас A і B і, відповідно, D - Or4 з стійкістю до A, B і C, а також до раси E - Or5 з стійкістю до A, B, C та D [5 - 7]. Останніми роками засвідчується поява F і G рас (в Іспанії). Гени стійкості F були виявлені в деяких культивованих генотипах та диких формах соняшнику і, здається, надають стійкість раніше виявленим породам (A-E) [2-4, 8-10].
Боротьба з цим паразитом утруднена, оскільки кілька тисяч насіння, вироблених однією рослиною вовка, можуть бути легко розпорошені вітром, водою, тваринами, машинами, грунтом тощо, насіння залишаються життєздатними протягом 10-15 років [11] та хімічними методами, що застосовуються фізично та біологічно, паразита повністю не видаляють. Альтернативою є використання стійких до вовків культур, завдяки чому сьогодні продовжуються дослідження з метою виявлення та впровадження в племінний матеріал генів, стійких до цього збудника [1].
Використання методики RAPD [12] у поєднанні з BSA (груповий сегрегантний аналіз) [13] та використання молекулярних маркерів, тісно пов'язаних з генами стійкості, дозволили ідентифікувати ці гени у різних рослин, таких як Laptuca sativa [13]. стійкість ячменю до Rhynchosporium secalis [14], іржі [15] та ін. Після побудови карти RFLP у соняшнику [16] та BSA були виявлені маркери RFLP, пов’язані з генами стійкості борошна PL1, Pl2 та Pl 6 [17-19]. Всі три цих гени були пов'язані з однаковим набором маркерів RFLP і утворюють кластер лінкерної групи 1 [19].
Метою нашого дослідження було виявити наявність гена Or5 у деяких гібридах та лініях соняшнику. Матеріал і методи Характеристика об’єкта дослідження. Десять квіткових гібридів (F1) служили рослинним матеріалом-
(Valentino, Xenia, Performer, Oxana, Vitalia, Drofa, Turbo, Favorit, Alkazar and Olga), батьківські лінії чотирьох гібридів (Performer, Oxana, Xenia, Valentino) та 11 генотипів андростера, позначених цифрами від 1 до 11 відповідно. Насіннєвий матеріал було надано CCŞ „Magroselect” SRL Soroca.
Умови культури in vivo. Рослини вирощували у рослинних горщиках, при температурі 24-26 ° С, фотоперіодичності 14-16 годин, вологості 60%. Матеріал збирали та аналізували на стадії 6-8 справжніх листків.
Методи дослідження вилучення ДНК. Геномну ДНК екстрагували з листя соняшнику за допомогою DAN-золу [20]. Очищення
ДНК проводили неодноразово зі 100% спиртом, потім із 75% спиртом. Осад, отриманий після висушування, розчиняли в автоклавованій дистильованій воді. Концентрацію ДНК визначали спектрофотометрично.
ПЛР-реакція. Ампліфікацію проводили за допомогою специфічних праймерів SCAR - RTS05, синтезованих на основі вихідного фрагмента полімеру RAPD - OPJ18_650. Нуклеотидна послідовність маркера SCAR (Alpha DNA, Канада) така:
ВИВЧЕННЯ I A UN IVERS I TAT I S
Науковий журнал Державного університету Молдови, 2008, № 2 (12)
F (5´-TGGTCGCAGATGGACGTGTGGGTG-3´), R (5´- GTCGCAGAGAGTGAGAGAGAGTGT-3´). Реакцію ампліфікації проводили в обсязі 25 мкл, що містить дистильовану воду, 5X ПЛР-буфер, суміш
нуклеотиду dNTP (2 мМ), Taq-полімераза 1u/мкл (Німеччина), праймер 50 п.н., І - 6 мкл. Ампліфікацію проводили за допомогою автоматичного термоциклу (Корбет, Австралія) з наступними умовами: I) денатурація: 94ºC - 4 хв. (цикл); II) 45 циклів, 1) денатурація: 93ºC - 1 хв., 2) ренатурація: 63ºC - 1 хв., 3) подовження: 72ºC - 4 хв .; III) питоме подовження: 72ºC - 6 хв. Електрофорез продуктів ампліфікації тривалий час проводився в 1,4% агарозному гелі в буфері TAE.
однієї години при 80 В. Гелі візуалізували в УФ-камері та фотографували. Розмір ампліфікованих фрагментів ДНК порівнювали зі стандартним маркером (Драбина ДНК 100pb, Promega, США).
Результати та обговорення Більшість літературних даних свідчать про домінуючий моногенний детермінізм стійкості до рас A - E
вовків [3,10,21,22]. Однак деякі посилання виявляють більш складне успадкування характеру, включаючи два домінантні гени [8], один рецесивний [23], подвійний рецесивний епістаксис [24] або навіть кількісне успадкування. Недавні дослідження показують, що стійкість до вовків визначається кількісними та якісними полігенними механізмами [25,26]. Ідентифікація генетичного детермінізму стійкості все більше базується на використанні специфічних молекулярних маркерів ДНК [26], включаючи молекулярні маркери, пов'язані з геном Or5, які надають стійкість до раси Е [27], використовуючи метод BSA [13].
На сьогоднішній день ідентифіковані маркери RAPD (UBC120_660) і маркери SCAR (RTS05, RTS28, RTS40, RTS29 і RTS41), пов'язані з Or5, і розроблена карта груп зв'язків для гена Or5, близько 22,5 cM дистально - це маркер RAPD і, від 5,6 cM до 39,4 cM проксимально, 5 маркерів SCAR. Ця група зв'язків була розміщена в групі 17 (LG17) карти CARTISOL RFLP [27]. Tang (2003), використовуючи той самий метод (BSA), помістив ген Or5 в теломерну область лінкерної групи 3 (LG3) після картографування маркерів SSR [28], причому найближчий маркер SSR нанесений на карту 6,2 cM проксимальніше локусу Гени Or5.
У цій роботі було вивчено 29 генотипів соняшнику з метою дослідження гена Or5. Виходячи з результатів, отриманих Lu et al. (2004), після аналізу BSA, вони виявили, що одним із найближчих маркерів SCAR є маркер RTS05, що відображається на відстані 5,6 см проксимальніше гена Or5; У своєму дослідженні ми використовували цей маркер з початковим фрагментом праймера RAPD - OPJ18_650 з продуктом ампліфікації 650 bp.
ВИКОНАВЕЦЬ ОКСАНА КСЕНІЯ ВАЛЕНТИНО
Фото 1. Результати ампліфікації ДНК специфічним маркером SCAR (RTS05) у різних сімействах соняшнику: М - молекулярні маркери; С - контроль без ДНК.
Аналізуючи отримані результати (Фото.1) щодо груп генотипів (гомозиготні лінії по батькові та гібрид F1), що складають гібриди Xenia, Performer, Valentino та Oxana, в результаті реакції ампліфікації з парою специфічних праймерів, згаданих про наявність продукту 650 bp у всіх генотипів, крім материнської лінії гібриду Xenia. Дані, що дозволяють припустити, що ці генотипи мають ген Or5, а його відсутність у материнському генотипі Ксенія - що ця лінія сприйнятлива до раси Е.
Ідентифікацію локусу, зв’язаного з геном Or5, також проводили на 11 андростерильних лініях та 10 гібридах соняшнику (фото 2 та 3). Амплікон 650 п.н. був отриманий в андростерильних лініях 1-3, 8-11 та в гібридах Виконавець, Оксана, Ксенія, Турбо, Фаворит, Алькасар та Ольга.
Отримані результати вказують на те, що згадані лінії та гібриди мають стійкість до Е породи вовків. В андростерильних лініях 4-6 та в гібридах Valentino, Vitalia та Drofa амплікон 650 bp слабо виділений, а в андростерильній лінії No 7 він відсутній.
Відповідно до даних літератури [2] про прямий зв’язок між генами стійкості (Or1 - Or7), наявними/відсутніми у виду Helianthus annuus L. та у порід (A - G) Orobanche cumana Wallr., Ми теоретично визначили чутливість або стійкість досліджуваних генотипів порівняно із сімома існуючими породами вовків (табл. 1-3).