Прот; інеси

Білок. Очищення (вправи)

очищення білка включає кілька методів у хроматографії, осадження солі, електрофорезу, центрифугування.

питання 1.
Які причини використовують осадження сульфату амонію як початковий етап очищення білка?
(Відповідь 1)

Відповіді. Деталі Відповідь на Q1 (Питання 1)
Осадження сульфату амонію (фракціонування сульфатом амонію, виділення) використовує критерій розчинності білка. Це дозволяє концентрувати цікавий білок, осідаючи неспецифічним чином, як правило, велику частку білків, що містяться в загальному екстракті. Отримується сирий екстракт (часткове очищення) білка, який потім може пройти подальші етапи очищення.

Відповіді. Подробиці (продовження) Відповідь на Q2 (Питання 2)
Для того, щоб елюювати білки, зв’язані з іонообмінною смолою, пропонуються дві можливості: 1/використовувати рН або сольовий градієнт (як правило, NaCl). Якщо ми вирішили використовувати градієнт NaCl, ми, як правило, починаємо з буфера з низькою іонною силою, за яким слідує серія буферів, концентрація NaCl поступово зростає (можна використовувати безперервний градієнт). Іони Na + або Cl від'єднують білки від колонки, нейтралізуючи негативні або позитивні заряди, що дозволяють білкам взаємодіяти зі смолою. В результаті відбувається елюція білків відповідно до їх щільності заряду. Насправді, щоб відірватися від катіонообмінної колони (CM-целюлоза), білки з меншою кількістю позитивних зарядів потребуватимуть меншої кількості Cl-іонів (отже, менша концентрація NaCl) для нейтралізації своїх зарядів, ніж білки з більш позитивними зарядами. Така ж логіка стосується іонів Na + під час елюції білків, приєднаних до аніонообмінної смоли (DEAE-целюлоза).

У випадку цієї вправи ми можемо зробити висновок, що:
- міоглобін елююється спочатку, оскільки не буде прикріплюватися до колонки (рН

- pI уреази (5.4) ближче до рН буфера, ніж pI овальбуміну (4.6): отже, уреаза матиме менш негативний загальний чистий заряд, ніж овальбумін. Тому можна передбачити, що уреаза буде елююватися при меншій концентрації NaCl, ніж необхідна для елюювання овальбуміну.
Таким чином, порядок елюції буде таким: 1: міоглобін (не утримується смолою), 2: уреаза і 3: овальбумін.

Відповідь на Q3 (Питання 3)
Діетиламіногрупа (-CH2-CH2-NH + -CH2-CH3) DEAE-целюлози несе позитивний заряд, який є основою роботи цієї колони. Це пояснюється тим, що негативно заряджені амінокислоти/білки будуть зв’язуватися (за допомогою електростатичних зв’язків) з діетиламіногрупою, тоді як позитивно заряджені амінокислоти/білки будуть знаходитися в елюенті. Як група діетиламіно має рКа, близьку до 8,5, ця група буде депротонована при рН більше 8,5, що усуває всю її здатність зв'язувати негативно заряджені речовини.

Відповідь на Q4 (Питання 4)
Має рН більше ніж 6 (pI 6-фосфоглюконатдегідрогенази), цей фермент має загальний негативний заряд (pH> pI). Його можна прикріпити до колони DEAE-Целюлоза. Має рН більше ніж 9, діетиламіногрупа колонки втрачає свій протон, одночасно запобігаючи будь-якому поділу ферменту відповідно до його заряду.

Відповідь на Q5 (Питання 5)
а) Ні, оскільки CM-целюлоза (CM = карбоксиметил = -CH2-COOH), будучи негативно зарядженою, є катіонообмінною смолою. При рН більше 6 6-фосфоглюконатдегідрогеназа заряджена негативно і тому не може зв'язуватися з колоною.
b) Для того, щоб відокремити 6-фосфоглюконатдегідрогеназу на колонці з CM-целюлозою, потрібно переконатися, що білок має загальний позитивний заряд. Отже, рН буфера має бути менше, ніж pI білка, тобто менше 6.

б) Для того щоб визначити, яка стадія була найбільш ефективною при очищенні ферменту, необхідно розділити ступінь очищення після стадії х на ступінь очищення попередньої стадії. Таким чином, стадія хроматографії на DEAE дозволила найбільше очистити фермент, тобто 36 разів (= 110,5/3; 07).
Висновок щодо протоколу очищення випливає з очищення ферменту Е: Цей протокол (складається з 6 етапів) дозволяє очистити фермент 820,5 рази, зберігаючи 41,5% вихідного ферменту (тобто втрата 58,5% вихідного ферменту).проти) Враховуючи, що білок є чистим після молекулярного просіювання, ми будемо збирати 35 мг ферменту Е. Це відповідає 41,5% кількість ферменту, спочатку присутнього в екстракті (вихід). Таким чином, у нашому початковому екстракті ми мали: 35 мг/41,5% = 75,9 мг
І ця кількість ферменту спочатку було в 70 000 мг білка. Отже, ми мали в сирому екстракті: (75,9 мг/70000 мг) х 100 = 0,108% ферменту Е

Корисні посилання

Книга 'Науки про життя. Білки та ферменти '(+ DVD), Baaziz, 2013: Виправлена MCQ, Виправлені вправи, Виправлений контроль у клітинній біології та біохімії для S1, S3, S4 та S5.

Для того, щоб мати можливість надалі обслуговувати відвідувачів, підтримуйте наші дії на сайті між ними, купуючи книги та навчальні матеріали, призначені для вдосконалення викладання та наукових досліджень з біохімії.

Адреса

Факультет наук Університету Каді Айяд
Марракеш, 40000, Марокко