Протокол тренувальних тренувань TreadWheel для м’яко індукованих вправ при Drosophila melanogaster

Резюме

TreadWheel використовує обертальний рух, щоб м’яко стимулювати фізичні вправи у дорослого Drosophila melanogaster, використовуючи переваги вродженого, негативного геотаксису. Це дозволяє аналізувати взаємодію між фізичними вправами та такими факторами, як генотип, стать та дієта, та їх вплив на фізіологічні та молекулярні тести для оцінки метаболічного здоров'я.

Анотація

Вступ

Епідемії ожиріння серед дітей та дорослих зростають у культурах, які споживають висококалорійні дієти і залишаються неактивними протягом тривалого періоду часу, що може призвести до серйозних довгострокових наслідків, включаючи резистентність до інсуліну, хронічне запалення та артроз 1, 2, 3, 4. Поширеність цих розладів продовжує зростати через зростаючий дисбаланс між споживанням і витратою калорій, що пояснюється збільшенням споживання жирів і цукрів та переважно малорухливим способом життя 5. Відповідно, цей енергетичний дисбаланс призвів до збільшення захворюваності на цукровий діабет 2 типу (T2DM) та серцево-судинні захворювання (CVD) 5. Люди мають більший ризик розвитку обох розладів, якщо їм діагностовано метаболічний синдром (MetS), абдомінальне ожиріння та симптоми дисліпідемії 2. MetS формується через складну взаємодію між генотипом та різними факторами навколишнього середовища, такими як дієта та фізичні вправи 6. Отже, щоб отримати повне розуміння основних механізмів цієї складної хвороби, розглянемо всі ці фактори.

Що стосується боротьби з MetS, лікарі спочатку рекомендують зазнати змін у способі життя, які включають здорове, збалансоване харчування та фізичну активність 2, 7, 8. Оскільки ефективні ліки обмежені, а шунтування шлунка є дорогим і вимагає медичного нагляду протягом усього життя, фармакологічні та хірургічні втручання рекомендуються лише у важких випадках і лише разом із цими змінами способу життя 3, 7, 8. Під час втручань у спосіб життя, таких як B. Фізичні вправи та дієта, які можуть забезпечити та підтримувати довгострокові цілі зниження ваги, незалежно від того, чи можуть ці коригуючі дії повністю пом'якшити негативні наслідки, пов'язані з MetS, потребують подальшого дослідження 7, 8 .

Моделі мишей використовувались для вивчення впливу фізичних вправ на порушення обміну речовин протягом багатьох років; однак запровадження досліджень вправ для польоту на MetS є відносно новим завданням 9, 10, 11, 12. Мухи є ідеальним транспортним засобом для вивчення фізичних вправ у контрольованому лабораторному середовищі, оскільки ними легко маніпулювати, вони мають короткий термін життя, недорогі в обслуговуванні, а енергічні шляхи обміну речовин високо захищені між дрозофілою та людьми 13. D. Геноми меланогастра добре охарактеризовані, і існує безліч генетичних інструментів для використання у дрозофіли, які дають уявлення про різні генотипи та взаємодії генотипів із оточенням, які можуть модулювати вплив фізичних вправ на здоров’я організму 14 .

Щоб обережно викликати фізичні вправи у дрозофіли, ми розробили тренажер, який називається TreadWheel (малюнок 1). Колесо TreadWheel (відтепер скорочене як TW) обертальним рухом викликає вроджену негативну тенденцію геотаксису під дією сили тяжіння на вершині флакона, що, в свою чергу, стимулює залізти на льоту для постійного переосмислення. На відміну від інших методів, поворотний рух ТВ по своїй суті є м'яким, що мінімізує кількість додаткових стресорів, які можуть виникнути і вплинути на результати. Таким чином, машинні вправи у великій кількості мух без стресу дозволяють вивчити вплив фізичних вправ на метаболічний стан здоров’я (Рисунок 2), Старіння, сон та багато інших тем 11 дозволять.

Наш метод дотримується зворотного пірамідального, інтервального тренувального протоколу, який в основному включає аспекти аеробних інтервальних тренувань (AIT) з певною фізичною підготовкою на витривалість. Стандартний режим AIT змінюється в цьому протоколі, збільшуючи тривалість кожного інтервалу протягом п’яти днів, щоб заохотити витривалість. AIT особливо корисний для запобігання MetS порівняно з іншими методами втручання та був більш ефективним у зміненні загальних факторів ризику метаболічного синдрому, ніж постійні помірні фізичні вправи 19, 20. Однак недоліком TW щодо Power Tower є те, що мухи швидше звикають до поворотних рухів, тому варіація вродженої тенденції звикати до прийняття мух може ускладнити інтерпретацію переваг вправи. Елегантне рішення цього обмеження описано Ватанабе та Загадкою 15 та їх додатковою статтею 21.

Протокол

1. Налаштування та експлуатація колеса протектора

Примітка: Див додаткова фігура 1 для принципових схем на TW Maschinenbau. Потрібні деталі знаходяться в Таблиця матеріалівперераховані. Фрази "TW", "TreadWheel", "навчальний пристрій" і "машина" використовуються як взаємозамінні у всьому протоколі.

  1. Калібруйте двигун з перемикачем увімкнення/вимкнення, щоб повний час обертання становив 15 с (4 об/хв). Швидкість машини перед флаконами для мух, прикріпленими до закріплених затискачів для калібрування обертових важелів.
    1. Відрегулюйте швидкість за допомогою стандартного секундоміра та нерухомого предмета, тимчасово прикріпленого до машини, як маленька щітка із стрічкою, прикріплена до кришки двигуна, щітка торкається обертового затиску. Встановіть час обертання кількості обертів за одну хвилину з нерухомим об'єктом як орієнтиром і відрегулюйте швидкість, щоб досягти періоду обертання 15 с (4 об/хв).

2. Політ та обслуговування мух

ПРИМІТКА: Про всіх мух доглядають в інкубаторі з температурою 25 ° C з вологістю 50% та 12-годинним циклом світло/темрява між описаними маніпуляціями. Мух годують стандартною дієтою сичужної патоки з кукурудзяної муки, якщо не зазначено інше.

  1. Підготуйте кожен генотип з яєчних соків агарових пластин, що закладають камери, по одній краплі дріжджової пасти на тарілку та пластикових пляшках на 6 унцій, збирають яйця, які вилуплюють личинки.
    1. Підготуйте пластинки агарового яблучного соку, заповніть чашки Петрі розміром 35 х 10 мм на 3/4, розчиніть 3% агару в придбаному яблучному соку. Зберігайте затверділі пластини в холодильнику до використання.
    2. У конічній пробірці для центрифуги об’ємом 50 мл з’єднайте придбані сухі дріжджі з дистильованою водою у співвідношенні 2 мл води на кожен грам дріжджів. Змішайте дріжджі з водою, щоб створити пасту консистенції кетчупу за допомогою скляного стрижня. Відрегулюйте пропорції дріжджів та води за необхідності для досягнення бажаної консистенції.
    3. Зберігайте дріжджову пасту в холодильнику між використаннями. Послабте кришку трубки, щоб забезпечити дегазацію.
    4. Гострою голкою або ножем пробийте невеликі отвори в пляшках із квадратним дном площею 6 унцій (поліпропілен) як вентиляційні отвори для кладок.
    5. Нанесіть невелику пляму на дріжджову пасту (

      Після денного відпочинку після завершення протоколу вправ, протестуйте загальний тест на ефективність підйому за допомогою швидкого ітеративного негативного аналізу сходження на негативний геотаксис (RING) 22 .
        Помістіть групи з 10 мух у порожні флакони з анестезією на СО2 (або торкніться безпосередньо з флаконів з їжею, якщо вони вже відсортовані) і закрийте парафіновою плівкою, щоб запобігти виходу мух. Дайте мухам принаймні 10 хвилин, щоб звикнути до нових флаконів. Щоб пляшка не перекинулася, скотчем

      Примітка: Зразки, стандарти, стандартний розчин гліцерину та робочий розчин тригліцерину, що використовуються під час випробування, слід зберігати на льоду протягом усього терміну дії протоколу та зберігати в холодильнику, коли вони не використовуються.

      Репрезентативні результати

      Ми особливо зацікавлені у визначенні факторів, що сприяють загальному метаболічному здоров’ю людини. Раніше було встановлено, що взаємодія генотипу за допомогою дієти суттєво сприяє зростанню популяції метаболічних властивостей 14. Це означає, що кожен генотип реагує на екологічні відмінності унікально і складно. Для того, щоб розширити нашу роботу над ефектами генотипу на довкілля, включивши фізичні вправи, ми розробили колесо TreadWheel, яке здатне виявляти численні генотипи для аеробних інтервальних тренувань (AIT) високопродуктивним способом.

      тренувальних

      ілюстрація 1 : Велотренажер TreadWheel. (А.) машина вміщує 48 флаконів і має функцію регульованої швидкості. Тут експерименти проводили при 4 об/хв. (B.) Індивідуальні харчові ампули з експериментальними мухами були затиснуті, обертовий вал зафіксований на своєму місці. (C.) Відстань між пробками для флаконів та їжею становила 6 см для флаконів для тренувань та 1 см для контрольних флаконів. Потім флакони розміщували на комп’ютері для вправ. (Д.) 5-денний режим вправ із зворотною пірамідою застосовувався для тренування польотів. Щодня до одного з прийомів вправ додавались додаткові п’ять хвилин, щоб поступово нарощувати інтенсивність тренувань, моделі витривалості, інтервальні тренування. Цю цифру взяли у Мендеса та ін. змінено 11. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

      treadwheel

      Малюнок 2 : Оптичні методи та репрезентативні результати. (А.) Методи перевірки дієти личинок та взаємодії з фізичними вправами дорослих. Личинок вирощували на жирних або звичайних лабораторних дієтах і переводили на локомотивні апарати на звичайному харчуванні. Дорослих мух розділяли за статтю, поміщали в експериментальні групи і вправляли протягом п’яти днів поспіль. Потім було проведено тест на сходження на негативний геотаксис кільцевого типу, і мух заморожували для вимірювання тригліцеридів. Репрезентативні дані тригліцеридів з'являються на двох генетичних лініях, Oregon R і y 1 w 1 для (B.) Самки та самці (C.). Усі мухи вирощувались на звичайному харчуванні і вправлялися у зрілому віці. Рівні з різними літерами суттєво різняться (стор. 11. Репрезентативні дані скелелазіння для лінії DGRP 153 для (Д.) Самки та самці (E.) відображається. Кожен пункт відповідає середній продуктивності скелелазіння 232 або більше людей за три незалежні моменти часу. Смужки помилок вказують на стандартну помилку. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

      тренувальних
      Додатковий малюнок 1: детальне схематичне зображення колеса протектора. (А.) Схема подвійного флакона з фіксатором, прикріпленого до машини. (B.) Вигляд зсередини поворотного приводу машини. (C.) Паралельна проекція передньої частини машини. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

      Обговорення

      Детально описаний тут протокол вправ успішно стимулює м’які вправи при дрозофілі і може бути використаний для імітації тренувань на витривалість у контрольованій лабораторії 11. Слід зазначити, що, розробляючи концепцію TreadWheel спочатку, ми розглядали комерційні продукти, які можна модифікувати для роботи подібним чином (наприклад, лабораторний ресторан). Однак ми в кінцевому підсумку відхилили цей підхід для вибору спеціально розробленої конструкції, оскільки комерційні пристрої не мали достатньо низької швидкості (4 об/хв) і не мали достатньої можливості флаконів для генерації зразків з високою пропускною здатністю.

      Дослідження з колесою TreadWheel показали, що в середньому фізичні навантаження знижували масу тіла, загальний запас тригліцеридів та глікогену, одночасно збільшуючи вміст білка та піднімаючись. Крім того, існували різні відповіді щодо статі та генотипів ваги тіла, а також рівня тригліцеридів, білка, глікогену, глюкози та рівня фізичного навантаження 11, 15. Хоча мінливість у відповіді на фізичні вправи та дієту між генотипами та статтю може бути важко інтерпретувати, а іноді, протилежним чином, вона відображає джерела справжніх біологічних змін, що спостерігаються у природних популяціях. Прагнучи зрозуміти різноманітність факторів, що лежать в основі високого показника MetS, ми розробимо інструменти, які полегшать розв'язання відносної важливості різних факторів впливу, протестуючи цей фактор у модельних організмах для розробки персоніфікованих заходів з профілактики та лікування. Для того, щоб повністю оцінити ефективність вправи, кожен з цих факторів і те, як вони взаємодіють, слід враховувати при проведенні експериментів та висновках.

      Розкриття інформації

      Автори нічого не розкрили.

      Подяка

      Ми хотіли б подякувати Джулі Джарніган, Мередіт Оуенс, Рейчел Хілл, Брендону Моє, Лаурі Мафлі, Олівії Фіш та решті лабораторії Рід за допомогу в розведенні мух та обробці зображень. Шон Мендес створив оригінальний TreadWheel за допомогою майстерні UAB. Це дослідження фінансувалось NIH R01 GM 098856 LKR Бакалаврська академія творчості та дослідницьких робіт при Університеті Алабами KEL та BJW.