Регулюйте експресію терапевтичного трансгену за допомогою кислотодефіцитної дієти

Ален Брухат 1, Седрік Шаверу 1, Валері Карраро 1, Селін Жусс 1, Жюльєн Аверус 1, Енн-Кетрін Морен 1, Лоран Пері 1, Флоран Месклон 1, Юкі Мураніші 1, Патрік Баріл 2, Ан До Тхі 3, Філіп Равасар 3, Jacques Mallet 3, 4 та Pierre Fafournoux 1 *

1 відділ харчування людини, UMR 1019, INRA Клермон-Те, університет Клермон-Ферран 1, 63122 Saint Genès Champanelle, Франція
2 Центр молекулярної біофізики, CNRS UPR4301, Університет Орлеана, Інсерм, Орлеан, Франція
3 CNRS UMR7225, Inserm U1127, Університет П'єра та Марії Кюрі, Інститут мозку та мозку (ICM), Команда біотехнологів та біотерапії, Париж, Франція
4 Кафедра неврологічної хірургії, Каліфорнійський університет, Сан-Франциско (UCSF), Сан-Франциско, Каліфорнія, США

Генна терапія передбачає введення гена в клітини для лікування або попередження захворювання. Потім цей ген може замінити дефектний ген у разі генетичного захворювання або зробити можливим виготовлення та розподіл терапевтичної молекули на місцевому рівні. Одним з основних обмежень використання генної терапії є відсутність контролю над експресією трансгену (гена, введеного в організм) [1]. Єдині поточно індуковані системи, описані у мишей, вимагають експресії екзогенних регуляторних білків (рецепторів), а також індукуючих хімічних молекул (таких як доксициклін 1, екдизон 2, рапаміцин 3 тощо). Однак потенційні побічні ефекти цих систем перешкоджають їх використанню в людській медицині.

Ми представляємо тут щойно розроблену нами систему, в якій експресія трансгену контролюється споживанням певної дієти, в якій незамінна амінокислота (AAI) відсутня [2].

Від харчування до генної терапії

Амінокислотний гомеостаз

У здорових здорових дорослих людей дев’ять амінокислот (валін, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, треонін, триптофан, гістидин) є важливими (AAI), тобто вони не можуть бути синтезовані de novo організмом і повинен забезпечуватися через їжу. Крім того, амінокислоти не мають спеціальної системи зберігання, як ліпіди (тригліцериди в жировій тканині) або глюкоза (глікоген). Тому у випадку дефіциту AAI в їжі механізми адаптації амінокислотного гомеостазу до цієї нової харчової ситуації є обов’язковими [3].

Дуже поширена харчова ситуація у всеїдних у дикій природі - це споживання дієти з дефіцитом однієї або декількох ААІ. Тварина, у розпорядженні якої лише одне джерело білка рослинного походження, може мати дефіцит однієї або декількох ААІ [3]. У гризунів та всеїдних тварин (щурів, мишей, свиней, курей тощо) було доведено, що споживання такого раціону спричиняє швидке та помітне зменшення споживання їжі. Цей фенотип є результатом виявлення мозку зниження плазмової концентрації обмежуючої амінокислоти. Така поведінка допомагає відкинути незбалансоване харчування та сприяє пошуку збалансованого харчування [4]. Цей приклад показує, що організм здатний виявляти брак амінокислот і регулювати певні фізіологічні функції, дозволяючи адаптацію до нової харчової ситуації. Для цього він активує специфічний сигнальний шлях, який регулює експресію певних білків, що беруть участь у механізмах адаптації до неадекватного споживання харчових речовин.

Сигнальний шлях GCN2/eIF2a/ATF4 активується через брак амінокислот

Наша команда продемонструвала, що відсутність AAI може регулювати фізіологічні функції за допомогою регулювання експресії генів-мішеней. Ми виявили елемент амінокислотної відповіді (AARE), розташований у промоторах цих генів [5]. Ми також сприяли характеристиці сигнального шляху, що активується дефіцитом AAI, і призводить до надмірної експресії генів-мішеней. Детектором дефіциту амінокислот є протеїнкіназа GCN2 (загальний контроль недоступний 2), який фосфорилюючи фактором ініціювання трансляції eIF2α (еукаріотичний фактор ініціації 2а), буде індукувати трансляцію фактора транскрипції ATF4 (активуючий фактор транскрипції 4; подивитися Фігура 1 докладніше) [6] (→).

(→) Див. Новелу А. Брухата та ін., РС n ° 12, грудень 2015 року, сторінка 1057

Ми також показали, що цей шлях є функціональним у природніх умовах. Він активується після вживання незбалансованої дієти при ААІ і дозволяє адаптувати певні фізіологічні функції. Наприклад, активація GCN2 в головному мозку приводить в дію механізм інгібування споживання їжі мишами [7].

Концепція

Ми використали властивості цього сигнального шляху для створення регуляторної системи, що складається із штучного промотору, сильно індукованого обмеженням в ААІ, та індуктора, їжі, дефіцитного в ААІ [2]. Ця система функціональна у природніх умовах, і може використовуватися для моніторингу експресії трансгену в протоколах досліджень або в дослідженнях генної терапії.

Промоутер

Використовуваний промотор містить елементи амінокислотної відповіді (AARE) гена TRB3 (Гомолог триблбів 3) злитий з мінімальним промотором тимідинкінази (ТК), який забезпечує сайт ініціації транскрипції. Кілька копій AARE клонували в тандемі для досягнення максимальної індукції. У відповідь на дефіцит AAI індукується сигнальний шлях GCN2/ATF4, а потім ATF4 надмірно виражається і зв'язується з копіями AARE для активації транскрипції.

Індуктор

Транскрипційна активація промотору, описаного вище, досягається шляхом спричинення зниження рівня AAI в крові після прийому дефіцитного прийому їжі. Слід зазначити, що концентрація амінокислот у крові особливо чутлива до незбалансованої дієти при ААІ, хоча загальний швидкий вплив на неї лише незначно впливає (пояснення див. [3]).

Така дієта повинна проводитися після нетривалого голодування і може бути подана як "коктейль" із вільних амінокислот або як повноцінна їжа, в якій білок замінюється сумішшю вільних амінокислот. Виснаження AAI в крові відбувається протягом декількох хвилин після вживання недостатньої їжі, і його можна дуже швидко зупинити введенням відсутнього AAI. Дефіцит будь-якої AAI є функціональним. Отже, при середньому або тривалому лікуванні можливо чергувати дефіцит різних ААІ, щоб уникнути харчових дефіцитів.

Доказ концепції

Спочатку ми протестували регуляцію експресії репортерного гена (люциферази) у мишей. Конструкція була трансдурована в різні тканини: печінку, підшлункову залозу або в певну область мозку, гіпокамп. Ми показали, що прийом їжі без AAI дуже швидко індукує експресію трансгену (Малюнок 2).

Контрольована експресія люциферази в печінці. Вектор, що містить промотор AARE (амінокислотний елемент відповіді) контроль експресії репортерного гена (кодує люциферазу) переносився в печінку тварин шляхом гідродинамічної ін'єкції, яка полягає у введенні великого об'єму розчиненої речовини в кров протягом дуже короткого періоду часу (кілька секунд). Під впливом (гідродинамічного) тиску розчинена речовина, що містить вектор AARE, транспортується безпосередньо до печінки і однорідно розподіляється по всьому цьому органу. На другий день після ін’єкції відносну активність люциферази вимірювали через 6 годин після споживання контрольованої (Ctrl) або недостатньої ізолейцин (Ile) дієти.

По-друге, ми оцінили ефективність терапевтичного гена, регульованого нашою системою, на підшкірній ксенотрансплантаційній моделі клітин гліобластоми у мишей оголена (при недостатній імунній системі). Лентивірусний вектор, що містить конструкцію, що дозволяє регулювати експресію проапоптотичного білка TRAIL (індукуючий апоптоз фактор некрозу пухлини, що індукує ліганд) вводили в пухлину. Потім мишей годували або контрольною дієтою, або недостатньою дієтою. (Малюнок 3). Наші результати чітко показують, що періодична та контрольована експресія TRAIL призводить до пригнічення росту пухлини [2]. Важливо, щоб його експресія була локалізована на місці пухлини і дуже тонко регулювалася. Дійсно, (1) TRAIL може бути потенційно токсичним для неспокійних клітин (нервових стовбурових клітин) при сильному та тривалому введенні; (2) крім того, білок TRAIL має дуже короткий період напіввиведення.

Особливості та переваги

Наша система експресії генів, яка регулюється харчовими продуктами, має ряд переваг: (1) вона використовує ендогенні молекулярні механізми. Отже, його індукція не зумовлена експресією екзогенних регуляторних білків, здатних породжувати імунологічні проблеми у господаря; (2) він не виявляє жодної токсичності. Ми перевірили, що чергування дієт, дефіцитних у різних ААІ, не впливає на худою масу; (3) він демонструє повну і швидку оборотність експресії трансгену, що дозволяє доставку терапевтичного білка шляхом " пульс "; (4) експресія трансгену може бути повторена з часом через чергування споживання дієт, дефіцитних різних ІАВ; (5) падіння плазмової концентрації обмежуючої амінокислоти буде відбиватися за гематоенцефалічним бар’єром і може безпосередньо націлити на цікавий для мозку ділянку.

На закінчення

Відкриття простого, надійного та безпечного способу регулювання експресії генів є головним проривом у галузі генної терапії та її різноманітних областях застосування. Дійсно, експресія гена препарату часто вимагає тонкої регуляції та точного дозування. Таким чином, ця система дасть змогу встановлювати нові методи лікування за допомогою генної терапії, досі немислимих [8].

Посилання, що цікавлять

Автори заявляють, що не мають ніякого інтересу стосовно даних, опублікованих у цій статті.

Дякую

Цю роботу фінансували ANR "Програми розвитку" (ANR-12-EMMA-0024) та STRESSOR (ANR-12-BSV2-0025-03).

Молекула сімейства циклінів, що використовується як антибіотик.