РОБОТА ПРЕДСТАВЛЕНА І ПУБЛИЧНО ПІДТРИМАНА НА ФАРМАЦІЙНОМ ФАКУЛЬТЕТІ МАРСЕЛІ 29 МАЯ 2019
РОБОТА ПРЕДСТАВЛЕНА І ПУБЛИЧНО ПІДТРИМАНА НА ФАРМАЦЕВТИЧНОМ ФАКУЛЬТЕТІ МАРСЕЛІ 29 МАЯ 2019 Г-жа Естель МЕНЮ Народилася 4 лютого 1992 року в Кімперле з метою отримання державної дипломи лікаря в аптеці ---- ooo ---- НАЗВАННЯ: ЕПІДЕМІОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО ВИЗНАЧЕННЯ ПАНЕЛІ З ДЕСЯТИ ШЛУНКОВО-кишкових паразитів у Марселі. СТАТТЯ ТЕЗИ ---- ооо ---- ДЖУРІ: Президент: прем'єр-міністр Філіп КОЛСОН ПУ-ПХ (ІГУ Медітеране Інфекція) Члени: Д-р Фаді БІТТАР (директор дисертації) МКУ (ІГУ Медітеранія Інфекція) Пр Стефан РАНКУ ПУ-ПХ (ІГУ Медітеране) Інфекція) Д-р Coralie L OLLIVIER MCU-PH (IHU Méditerranée Infection) Д-р Charles MARY MCU-PH (IHU Méditerranée Infection) Університет Екс-Марселя Фармацевтичний факультет 27 р. Jean Moulin CS 30064-13385 Марсель cedex 05 - Франція Тел.: +33 (0) 4 91 83 55 00 - Факс: +33 (0) 4 91 80 26 12
РОБОТА ПРЕДСТАВЛЕНА І ПУБЛИЧНО ПІДТРИМАНА НА ФАРМАЦЕВТИЧНОМ ФАКУЛЬТЕТІ МАРСЕЛІ 29 МАЯ 2019 РОКУ Естель МЕНЮ Народилася 4 лютого 1992 року в Кімперле з метою отримання державної дипломи лікаря у фармацевтиці ---- ooo ---- НАЗВАННЯ: ВИВЧЕННЯ ЕПІДЕМІОЛОГІЧНОГО, ЩО ТАКЕ МОЛЕКУЛЯРНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ПАНЕЛІ ДЕСЯТИ ШЛУНКОВО-кишкових паразитів, у Марселі. СТАТТЯ ТЕЗИ ---- ооо ---- ДЖУРІ: Президент: прем'єр-міністр Філіп КОЛСОН ПУ-ПХ (ІГУ Медітеране Інфекція) Члени: Д-р Фаді БІТТАР (директор дисертації) МКУ (ІГУ Медітеранія Інфекція) Пр Стефан РАНКУ ПУ-ПХ (ІГУ Медітеране) Інфекція) Д-р Coralie L OLLIVIER MCU-PH (IHU Méditerranée Infection) Д-р Charles MARY MCU-PH (IHU Méditerranée Infection) Університет Екс-Марселя Фармацевтичний факультет 27 р. Jean Moulin CS 30064-13385 Марсель cedex 05 - Франція Тел.: +33 (0) 4 91 83 55 00 - Факс: +33 (0) 4 91 80 26 12
ЛЕКТОРИ БІОФІЗИКА ГЕНЕТИЧНА ТА БІОТЕХНОЛОГІЯ ГАЛЕНІЧНА АПТЕКА, ПРОМИСЛОВА ФАРМАКОТЕХНІКА, БІОФАРМАЦІЯ ТА КОСМЕТОЛОГІЯ ПИТАННЯ ТА ДІЄТИКА Г-н. -БУРГАРЕЛЬ пан Паскаль ПРИНДЕРЕР пан Еммануель ОСТОРОЖНО пані Веронік АНДРЕ пані Марі-П'єр САВЕЛЛІ г-н Леопольд ЧІАКПЕ АХУ КЛІТИННА ТЕРАПІЯ г-н Жеремі МАГАЛОН УЧИТЕЛІ АНГЛІЙСЬКОГО ДОГОВОРНОГО ДИСФАРА ПРОФЕСОР ФІОЛОГІЇ GOODWIN Філіпп БІОПІ ФУНДАМЕНТ, МОЛЕКУЛЯРНА І КЛІНІЧНА КЛІТИЧНА БІОЛОГІЯ ГЕМАТОЛОГІЯ І ІММУНОЛОГІЯ МІКРОБІОЛОГІЯ ПАРАЗИТОЛОГІЯ ТА МЕДИЧНА МІКОЛОГІЯ Пані Жан-ЖА Пані -Марк РОЛЕН Пан Філіп Ко ЛСОН Пані Надін АЗАС-КРЕДЕР 4
МАЙСТЕРИ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЇ, МОЛЕКУЛЯРНОЇ І КЛІНІЧНОЇ БІОХІМІЇ ГЕМАТОЛОГІЇ І ІМУНОЛОГІЇ МІКРОБІОЛОГІЇ ПАРАЗІТОЛОГІЇ ТА МЕДИЧНОЇ МІКОЛОГІЇ, ГІГІЄНИ І ЗООЛОГІЇ КЛІТИННА БІОЛОГІЯ Пані Доміне ЖОРЕНЬ ШОШ МАРШЕН ЖУРНЕ ЖАНЕ ЖОРЕНЬ Мішель ЛАГЕТ Пан Мішель ДЕ МЕО Пані Ен ДЕВІН-РЕГЛІ Пані Веронік РУК Пан Фаді БІТТАР Пані Ізабель ПАНЬЄ Пані Софі ЕДУАР Пан Сейдіна Мухамаду ДІЄНЕ Пані Карол ДЖІОРЖІО Пан Орельєн ДУМЕТРЕ Пані Магалі КАЗАН Аніта КОГЕН Пані Ен-Катрін ЛОМЕ АГУ ГЕМАТОЛОГІЯ І ІМУНОЛОГІЯ Г-н Максим ЛОЙЕНС ФАРМАЦЕВТИЧНА ХІМІЯ Відділ відповідальний: професор Патріс ВАНЕЛЛ ПРОФЕСОРИ ХІМІЯ АНАЛІТИКА, КВАЛІТОЛОГІЯ ХІМІЧНА ХІМІЧНА ХІМІЧНА ХІМІЧНА ХІМІКА ОРГАНІЧНА ФАРМАЦЕВТИЧНА ФАРМАКОНОЗІЯ, ЕТНОФАРМАКОЛОГІЯ, ГОМЕОПАТІЯ Пані Кетрін БАДЕНС Містер Філіп ГАЛЛІСІ Пан Паскаль РАТЕЛО Пан Максим КРОЗЕ Пан Патріс ВАНЕЛЬ Пан Тьєррі ТЕРМЕ Пані Евелін ОЛЛІВ'Є 5
ЛІКАРСЬКІ ЗАСОБИ І БЕЗПЕКА ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я ВІДДІЛ Відповідальна особа: професор Бенджамін Guillet ВЧИТЕЛЯ КЛІНІЧНА ФАРМАЦІЯ PHARMACODYNAMY ЗАГАЛЬНІ токсикології екотоксикології Г - жа Діана BRAGUER г - н Stéphane Оноре г - н Бенджамін Guillet г - н Бруно LACARELLE г - жа GRIMALDI І ФАРМАКОЛОГІЯ TOARMACARELLE І КОНФІДЕНЦІЙНО PHARMOCALE І Фармакодинамическое CLINIQUE Г - н Гійом ХЕЙЧ Пані Алем БУЛЕЛ Пан Філіп ГАРРИГ Пані Сільвіан ЛОРТ Пані Еммануель МАНОС-САМПОЛ Пан Жозеф ЦІККОЛІНІ Пані Рафаел ФАНЧІЛЛІНО Пані Флоренція ГАТТАКЕКА Пан П'єр-Анрі ВІЛЯРД Пані Кароліна СОНА ШЕНЕ ШЕНЕ AHU ФАРМАЦІЙНА КЛІНІЧНА ФАРМАКОКІНЕТИКА Пан Флоріан КОРРЕАР Пані Надеж НІЯКИХ 7
Викладання зборів на факультеті Пані Валері АМІРАТ-КОМБРАЛЬЄ, лікарський лікар-практик пан П'єр БЕРТО-ПЕРЕС, лікарський лікар-практик пані Марі-Елен Берточчо, лікарський лікар-фармацевт пані Мартін БЮЗ-ШАРБІТ, лікар лікарської практики Ніколас КОСТ, лікарський лікар-практик пані Софі ГЕНСОЛЕН, лікарняний лікар-практик пан Сільвен ГОНЕТ, призначений фармацевт пані Флоренс ЛІАНДРО, помічник фармацевта пан Стефан ПІШОН, призначений фармацевт пан Патрік РЕДЖІО, фармацевт-консультант, DRSM з медичного страхування пані Кліменс ТАБЕЛЕ, асоційований фармацевт-практик пані ТОННЕУ-ПФУГ, помічник фармацевта пан Бадр Еддін ТЕХАНІ, лікарський лікар-практик пан Йоел ВЕЛЛОЦЗІ, дипломований бухгалтер Оновлено 22 лютого 2018 р.
Пані Коралі Л ОЛЛЬВЬЄ, Дякую за участь у роботі журі моєї дипломної роботи. Дякуємо за ці моменти, проведені в лабораторії у вашій присутності, щоб поділитися своїми незмінними знаннями, пристрастю до дисципліни, багатьма порадами та підтримкою цього проекту та іншими. Я навчився і багато чому вчусь у вас. Ваша доступність, ваше терпіння і ваша педагогіка викликають захоплення і є зразковими для багатьох стажерів. Я завжди був би вдячний, якщо б ви погодились наставником мене за мою майбутню наукову дисертацію. Завдяки тобі. Цілій команді паразитологів, яка не входить до складу мого журі, Керол та Белла, дякую за ваш щоденний гарний гумор, яке задоволення працювати з вами. 10
Найглибша подяка моїй родині. Моїм батькам, Дякую за вашу безперебійну підтримку та заохочення в моїх особистих та професійних проектах, як Середземноморських, так і за Атлантикою. Саме завдяки вам я зміг провести ці довгі та красиві навчання і тепер у мене є казкова робота. Я буду тобі вічно вдячний. Моєму братові та моїй сестрі Віктору, дякую за вашу радість, гордість, яку ви мені надаєте, і за те, що ви завжди поруч, навіть коли вам доводиться зволікати з виїздом за кордон. Барбара, дякую, що ти присутні у будь-яких обставинах, підтримуєш мене у всіх моїх рішеннях і залишаєшся моїм зразком для наслідування. Ремі, моя кохана, дякую тобі за те, що ти пішов за мною у всіх моїх проектах, а також за поради та дорогоцінну допомогу, яку ти дав мені під час цієї роботи. Дякую за вашу любов, усі чудові моменти, вже проведені разом, і майбутнє, яке я не уявляю без вас. Моїм друзям, Жанна, ти підтримуєш мене протягом 27 років, незважаючи на відстань, дякую. Марін, Кетрін, Шарлотта, Ен-Шарлотта, Мод і Сак, До всіх добрих часів, проведених разом, у Бретані, Марселі та за кордоном! Ти мій камінь. Одрі, я підсумовую подяку культовою фразою “gracia por el amor”. 11
Софі, Дякуємо за ваш бездоганний гарний гумор, наші незабутні частини про "пандемію". Девід і Саймон, чоловічий дотик цієї ударної команди. Команда Гайани та команда лікарні Cayenne за їхні щоденні інвестиції та їхні чудові людські якості. Емма, найкраща сусідка по кімнаті, яку я коли-небудь знав, тропічний ліс Амазонки (майже) не має для нас секретів. Матільда, яка відкрила мені очі на тест, представлений дисертацією. Павло, дякую за твій постійний гумор та дорогоцінні поради. Фелікс, дякую за твої завжди вражаючі маскування. Стефанія, Лоре, Ельза, для наших спогадів про каное - карбети, про які я мріяв, коли цілими днями писав цю дисертацію. Усім моїм стажистам, бо вибір стажиста завжди винятковий. Усім людям, яких я зустрічав на своєму курсі, адже кожна зустріч унікальна. Дякуємо всім інженерам та технічним працівникам, які долучились до цього проекту. 13
«Університет не має наміру схвалювати або заперечувати думки, висловлені в тезах. Ці думки слід розглядати як специфічні для їх авторів ". 14
ЗМІСТ ВСТУП. 19 ЧАСТИНА I Огляд літератури Шлунково-кишкові паразити, що представляють медичний інтерес, та їх діагностичні методи в лабораторії. 22 1. Найпростіші та мікроспорідії, що становлять медичний інтерес. 23 1.1 Загальна інформація про найпростіших. 23 1.2 Епідеміологія шлунково-кишкових паразитів у розвинених країнах. 24 1.3 Спосіб передачі, цикл, патогенність. 26 Balantidium coli. 26 Blastocystis spp. 27 Cryptosporidium parvum/hominis. 27 Cyclospora cayetanensis. 29 Cystoisospora belli. 30 Dientamoeba fragilis. 31 Entamoeba histolytica. 32 Microsporidia: Encephalitozoon intestinalis, Enterocytozoon bieneusi. 33 Giardia intestinalis. 34 1.4 Лікування. 38 2. Лабораторні методи діагностики. 38 2.1 Мікроскопічна діагностика. 39 2.2 Виявлення антигенів у калі. 45 3. Молекулярна діагностика в лабораторії. 49 3.1 Принцип та інтерес. 49 3.2 ПЛР у режимі реального часу. 52 3.3 Попередня обробка. 56 3.4 Вилучення ДНК. 57 3.5 Нові методи діагностики. 58 ЧАСТИНА II Стаття. 60 1. Вступ та резюме статті. 61 2. Статті. 62 2.1. Стаття 1: Попереднє дослідження. 63 2.2. Стаття 2: Основне дослідження. 70 ЧАСТИНА III Обговорення. 79 ВИСНОВОК. 87 БІБЛІОГРАФІЧНА ЛІТЕРАТУРА. 88 ДОДАТОК 1. Присяга Галена. 107 15
СПИСОК ТАБЛИЦ ТАБЛИЦЯ 1. ПІДСУМОК ПЕРЕДАЧИ ТА ПАТОГЕННОСТІ ПРОТОЗОЇ ТА ПАТОГЕННИХ МІКРОСПОРІДІЙ МЕДИЧНИХ ІНТЕРЕСІВ (Здійснено З ДОСЛІДЖЕННЯ ФЛЕТЧЕРОМ І ДР. [5]). 36 ТАБЛИЦЯ 2. ЛІКУВАННЯ ІНФЕКЦІЙ ПРОТОЗОЮ ТА МІКРОСПОРІДІЮ. 38 ТАБЛИЦЯ 3. ОСНОВНІ МЕТОДИ КОНЦЕНТРАЦІЇ ПАРАЗІТІВ В СІДЛІ (БЕЗ КОМПЛЕКТІВ, ЩО ГОТОВІ ДО ВИКОРИСТАННЯ). 42 ТАБЛИЦЯ 4. АНТИГЕНИ, ВИЗНАЧЕНІ В НАБОРАХ, ДОСТУПНИХ НА РИНКУ. 48 ТАБЛИЦЯ 5. НЕВИЧИННИЙ СПИСОК, ЩО ПРЕДСТАВЛЯЄ РІЗНОМАНІТІСТЬ ПАНЕЛІВ ПРОТОЗОА І МІКРОСПОРІДІЙ, ВИЗНАЧЕНИХ МУЛЬТИПЛЕКСНОЮ ПЛР у РІЗНИХ ДОСЛІДЖЕННЯХ, Опублікованих у ЛІТЕРАТУРІ. 53 ТАБЛИЦЯ 6. СПИСОК КОМЕРЦІЙНИХ МУЛЬТИПЛЕКСНИХ НАБОРІВ, ДОСТУПНИХ НА РИНКУ, І ВИДАЧЕНО РІЗНИХ ПАТОГЕНІВ. 55 16
ТАБЛИЦЯ СКОРОЧЕНЬ ДНК: мРНК дезоксирибонуклеїнової кислоти: вісник рРНК рибонуклеїнової кислоти: рибосомальна рибонуклеїнова кислота Ct: пороговий цикл ІФА: Імуноферментний аналіз ФРЕТ: Флуоресцентний резонанс Передача енергії Тепло: Чоловік, що займається сексом з чоловіками 70 Шок Гепс ) ITS: Внутрішня транскрибована розпірна лампа: опосередкована петлею ізотермічна ампліфікація MALDI-TOF: Матрична допоміжна лазерна десорбція Іонізація - Час польоту ПЛР: Полімеразна ланцюгова реакція (полімеразна ланцюгова реакція) qpcr: Кількісна кількісна полімеразна ланцюгова реакція СНІД: Синдром набутого імунодефіциту SMX: Сульфаметоксазол ST: Підтип TDR: Швидкий тест на депізат TMP: Триметоприм HCV: Вірус гепатиту С ВІЛ: Віруси імунодефіциту людини VO: Пероральний шлях 18
за останні роки набори мультиплексних ПЛР здатні виявити до двадцяти збудників, з яких вийшли паразити [18 20]. Також доступні інші інноваційні інструменти в галузі протеоміки, такі як мас-спектрометрія типу Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight (MALDI-TOF MS), але вони стикаються з багатьма труднощами, які уповільнюють їх розвиток [21]. Для того, щоб надати французькі епідеміологічні дані, ми провели в Марселі проспективне дослідження, яке одночасно перевіряло qpcr на десять шлунково-кишкових паразитів (вісім найпростіших та два мікроспорідії), найчастіше зустрічаються у розвинених країнах. Вибір паразитів, яких слід шукати, ґрунтується на даних літератури. Згідно з оглядом Fletcher et al. [5], основними шлунково-кишковими найпростішими, що представляють інтерес для громадського здоров’я, є: Cryptosporidium spp., Giardia intestinalis, Entamoeba histolytica, Dientamoeba fragilis, Cyclospora cayetanensis, Blastocystis spp., Cystoisospora bellii та Balantitizo coli two microsporizoin biterosinusius. 21
ЧАСТИНА I Огляд літератури Шлунково-кишкові паразити, що представляють медичний інтерес, та їх діагностичні лабораторні методи 22
Рисунок 1. Класифікація протистів, запропонована Міжнародним товариством протолістів [22]. 1.2 Епідеміологія шлунково-кишкових паразитів у розвинених країнах Дослідження Флетчер та співавт. опублікована в 2012 р. оцінює кількість кишкових паразитів, виділених у хворих на діарейку, від 1 до 65% у розвинених країнах [5]. Ці паразити в основному найпростіші. Цей огляд літератури, проведений з 1980-х років, дає оцінку поширеності шлунково-кишкових паразитів у розвинених країнах. На малюнку 2, отриманому на основі даних цього дослідження, узагальнено поширення цих найпростіших у Європі. 24
25 Рисунок 2. Карта Європи на основі дослідження Флетчера та ін. [5], що представляє розподіл найпростіших, що представляють медичний інтерес.
Entamoeba histolytica Люди та інші цисти у необробленій або погано обробленій воді та на дизентерії, абсцесі іммігрантів/мандрівників до ссавців у непровареному або недостатньо прожареному стані; ендемічна печінка, ЧСЧ, ВІЛ-інфіковані та від людини до людини; зоонотичні люди у закладах Giardia intestinalis Люди, інші цисти у необробленій або погано обробленій воді та при діареї, молоді дорослі, ЧСЧ, працівники щоденного догляду ссавці та птахи Неварена або недоварена їжа; мальабсорбція від людини до людини; зоонозна мікроспорідія Людина та інші ссавці Проковтування спор; людина до людини; зоонозна Постійна діарея Пацієнти з ослабленим імунітетом та ВІЛ/СНІД, імунокомпетентні пацієнти, мандрівники ЧСЧ: чоловіки, які мають секс із чоловіками 37
Рисунок 4. Принцип імунохроматографічного тесту. Тест ELISA заснований на утворенні комплексу антиген-антитіло в рідкому середовищі та його виявленні (рис. 5). Паразитичні антигени, надані досліджуваним зразком, зв’язуватимуться з антитілами, заздалегідь ковалентно закріпленими в лунках. Тому антиген, що цікавить, зв’язується з твердим носієм, а потім промивається. Додають розчин, що містить антитіло, мічене ферментом і спрямоване проти цього антигену: це виявляється розчин. Він містить субстрат, який перетворюється у кольоровий продукт ферментом, зчепленим з виявляючим антитілом. Позитивність тесту буде визначена шляхом вимірювання оптичної щільності середовища при заданій довжині хвилі за допомогою спектрофотометра. Інтенсивність фарбування залежить від кількості присутнього антигену. Ці випробування проводять на 96-лункових планшетах, іноді упакованих у смужки. Рисунок 5. Принцип прямого тесту ELISA. 46
З огляду на велику кількість тестів, доступних на ринку, було проведено численні дослідження щодо чутливості та специфічності цих TDR або тестів ELISA, а також їх порівняння. Вони показали велику варіативність щодо їх чутливості та специфічності, існуючи помилкові спрацьовування та помилкові негативи для кожного з них [139]. Наприклад, у випадку виявлення Cryptosporidium spp., Швидкий діагностичний тест показав свою перевагу порівняно з мікроскопічним виявленням після модифікованого фарбування Ціля-Нельсена [140]. Нарешті, інтерес цих тестів, здається, полягає в простоті їх використання та швидкості отримання результату (менше години) у порівнянні з мікроскопічним дослідженням. TDR має ту перевагу, що є можливим за відсутності електроенергії та без необхідності досвідченого оператора. Що стосується методики ІФА, для зчитування оптичної щільності потрібна електрика. 47
Таблиця 4. Антигени, виявлені в наборах, доступних на ринку. Шукані антигени Техніка Виробник Посилання Торгова назва Cryptosporidium sp. Entamoeba histolytica Giardia intestinalis Coris [141], [142] Crypto-Strip BioConcept [143], [138] Cryptosporidium і Giardia Duo-Strip [144], [141] Giardia-Strip Immunochromatography ELISA Meridian Bioscience R-Biopharm Diagnostics [145], [146], [147], [148] ImmunoCard STAT! C/G [138] ImmunoCard STAT! CGE [141], [138] RIDA QUICK Combi [141], [142] RIDA QUICK Cryptosporidium [141] RIDA QUICK Giardia Remel [142] Xpect Cryptosporidium [145] Xpect Giardia/Cryptosporidium Savyon Diagnostics [149] Coprostrip Crypto Techlab Inc. [150], [151], [152] E.histolytica Quick Check [138], [145], Giardia/Cryptosporidium [153] Quick Check apdia [147] Giardia lamblia ELISA Biomerica [154] Giardia ELISA Cellabs [155] Entamoeba Діагностичний набір CELISA PATH [147] Криптоспорідій Антиген Автоматизація виявлення ELISA R-Biopharm [141] RIDA SCREEN Діагностика Криптоспоридій [141] RIDA SCREEN Giardia Remel [156] ProspecT ELISA Cryptosporidium [138] ProspecT ELISA E. ELISA Giardia [138], [158] ProspecT ELISA Giardia/Cryptosporidium Techlab Inc. [155] E.histolytica II ELISA 48
використовувані технології виявлення різняться залежно від наборів. Таким чином, деякі набори виявляють паразитів методом мультиплексної ПЛР у режимі реального часу (наприклад: аналізи шлунково-кишкової панелі AllplexTM (Seegene), шлунково-кишкові панелі DiagCORE v2 (Qiagen), панель паразитних табуреток RIDA GENE (R-Biopharm), інші використовуватимуть технологію мікрочипів (наприклад: Палата шлунково-кишкового тракту Filmarray (BioMérieux)) бачить комбінацію цих двох технологій (наприклад: паразити стільця Novodiag (Mobidiag)). У всіх випадках це повністю закриті системи, і біолог не може контролювати умови екстракції та посилення. Нарешті, одна численні основні гальма, здається, їх вартість. Численні недавні дослідження вивчали ефективність цих наборів [18, 20, 171]. Ці нові методи виявлення, засновані на синдромних діагнозах, як правило, ставлять під сумнів традиційні методи виявлення, такі як мікроскопія, чинний золотий стандарт.
ЧАСТИНА II Стаття 60