Роль шляху mtorc1s6k та RSK в енергетичному обміні - pdf завантажити безкоштовно

Роль шляхів mtorc1/s6k та RSK в енергетичному метаболізмі Кандидатська дисертація Міхаель Шум Докторантура з молекулярної медицини Філософський лікар (к.е.н.) Квебек, Канада Міхаел Шум, 2016

роль

Роль шляхів mtorc1/s6k та RSK в енергетичному метаболізмі Дисертація Міхаеля Шума Під керівництвом: Андре Маретт, керівник дослідження

Результати. 84 Обговорення. 88 Список використаної літератури. 93 Рисунки легенди. 97 Методи ESM. 107 Розділ II. 111 Передмова. 111 PF-4708671 регулює енергетичний гомеостаз, діючи як на гальмування S6K1, так і на мітохондріальний комплекс 1. 112 Анотація. 113 Вступ. 114 Методи. 115 Результати. 117 Обговорення. 119 Список використаної літератури. 124 Легенди до цифр. 129 Розділ III. 136 Передмова. 136 Інсулін активує RSK (p90 рибосомна S6-кіназа), щоб викликати нову петлю негативного зворотного зв'язку, яка регулює передачу сигналів інсуліну для метаболізму глюкози. 137 Резюме. 138 Анотація. 139 Методи. 141 Результати. 143 Обговорення. 149 Список використаної літератури. 154 Легенди до цифр. 159 IV - Загальна дискусія. 168 VI-Висновок. 184 Бібліографія. 185 ві

Список таблиць Розділ I Таблиця 1 Вплив 7-денного лікування PF-4708671 та рапаміцину на вагу, споживання їжі та метаболічні показники оброблених мишей. 96 vii

Raptor Регуляторно-асоційований білок mtor REDD1 Білкова транскрипційна регуляція відповіді на пошкодження ДНК 1 Rheb Ras-гомолог, збагачений у мозку Rictor Рапаміцин-нечутливий супутник mtor ROS Реакційний кисень Вид RSK p90 Рибосомний S6 кіназа RTK Рецептор з активністю тирозинкінази S6K1 p6 рибоза TSC1 Туберкульозний склероз 1 (туберкульоз) TSC2 Туберкульозний склероз 2 (гамартин) xi

Статті ǂ Статті, присутні в формі глави в цій дипломній роботі Статті, опубліковані ǂSmadja-Lamère N. *, Shum M. *, Déléris P., Roux PP., Abe JI. та Marette A. Інсулін активує p90 S6-кіназу RSK, щоб викликати нову петлю негативного зворотного зв'язку для регулювання сигналізації інсуліну для метаболізму глюкози. J Biol Chem. 2013, 25 жовтня; 288 (43): 31165-76 * Автори спільної роботи Сю Е, лісовий депутат, Шваб М, Аврамоглу РК, Сент-Аманд Е, Карон АЗ, Беллман К, Шум М, Воазін Г, Пакет М, Монтуді А, Lévy E, Siminovitch KA, Neel BG, Beauchemin N, Marette A. Гепатоцит-специфічна делеція Ptpn6 сприяє зростанню печінкових ліпідів, але зменшує NAFLD при ожирінні, спричиненому дієтою: Потенційна роль PPARγ, Гепатологія. 2014 травень; 59 (5): 1803-15. UmШум М., Беллман К, Сен-П’єр Р та Маретт А., Фармакологічне інгібування S6K1 збільшує метаболізм глюкози та передачу сигналів Akt in vitro та у мишей із ожирінням, індукованих дієтою, Diabetologia, 2016, березень; 59 (3): 592-603 статті при підготовці Шум М., Босой С., Лашанс Д., Ле Куанг К., Лапланте М. і Маретт А. Надмірна експресія DEPTOR запобігає серцевій дисфункції, спричиненій дієтою з високим вмістом жиру у мишей. UmШум М., Бельмаре В., Босуа С. та Маретт А. PF-4708671 регулює клітинний енергетичний гомеостаз, інгібуючи активність як S6K1, так і мітохондріального комплексу I xv

Рисунок 3: Цикл зворотного зв'язку, індукований mtorc1/s6k1 та ERK на шляху PI3K/Akt. Після активації рецептора інсуліну активується шлях PI3K-Akt, який стимулює активацію білків mtorc1, S6K1 та атипових PKC. Активація рецептора інсуліну також стимулює шлях MAPK, частиною якого є ERK та RSK. Як mtor, S6K1, ERK, так і атипові PKC регулюють передачу сигналів інсуліну, опосередковуючи петлю негативного зворотного зв'язку, фосфорилюючи залишки Ser IRS-1. Крім того, відомо, що S6K1 також регулює активність mtorc2 за допомогою фосфорилювання Rictor та Sin1. (Адаптовано з (58)) Крім того, деякі з цих шляхів також активуються факторами, що індукують або сприяють резистентності до інсуліну, таких як; фактор некрозу пухлини-α (TNF-α) (65), нестерифіковані жирні кислоти (NEFA) (66, 67), амінокислоти (68-70), клітинний окислювальний стрес (71, 72) та ангіотензин II (73, 74) . Кілька досліджень також показали на резистентних до інсуліну моделях тварин або людини, що дефектна інсулінова сигналізація найчастіше обумовлена ​​посттрансляційними порушеннями, спричиненими, серед іншого, mtorc1 та S6K1 (55, 69). 12

Рисунок 5: Регуляція транскрипції генів печінкового глюконеогенезу під час голодування та у фазі після їжі. (A) Під час голодування секреція глюкагону підшлункової залози збільшує активуючу РКА (протеїнкіназу А), яка фосфорилює CREB. Крім того, PKA також індукує дефосфорилювання CRTC2, інгібуючи SIK (індуковану солями кіназу) та активуючи фосфатази PP2B та SMEK/PP4C. Після активації CREB і CRTC2 вони транслокуються в ядро ​​і утворюють комплекс з коактиватором CBP/p300 для активації транскрипції PGC-1α. Разом CREB, CRTC2, PGC-α та FoxO1 регулюють експресію ферментів глюконеогенезу PEPCK та G6Pase. (B) Прийом їжі зменшує секрецію глюкагону та збільшує секрецію інсуліну підшлунковою залозою, що активує передачу сигналів інсуліну в печінці. Активація Akt інсуліном індукує активацію SIK, яка стимулює фосфорилювання CRTC2 та індукує фосфорилювання FoxO1, запобігаючи їх транслокації в ядро. Потім інсулін також підвищує активність транскрипційних репресорів глюконеогенних генів, таких як SHP, DAX-1 та TCF7L2. (Адаптовано з (43)) 16

Рисунок 7: Регулювання активації каналу mtorc1. Шлях mtorc1 активується факторами росту та інсуліном (детальніше див. Розділ 1.3). Сигнальні шляхи ERK та PI3K/Akt регулюють активацію mtorc1, регулюючи комплекс TSC на поверхні лізосом (детальніше див. Розділ 1.4.1.1). (Адаптовано до (87)) 1.4.1.1 Комплекс туберкульозного склерозу (TSC), інтегруючий центр, що регулює активність mtorc1. Комплекс TSC діє як ядро ​​для інтеграції декількох сигналів, таких як енергетичні рівні, через білок AMPK (5 'активована AMP протеїнкіназа ), фактори росту, запалення, пошкодження ДНК та кисню (рис. 8). Дійсно, комплекс TSC1/2 інгібується факторами росту, які активують ERK, RSK та Akt. Крім того, запалення активує шлях mtorc1, також інгібуючи TSC1/2 через активацію I-каппа β-кінази (IKKβ). Канонічний шлях Wnt може також інгібувати TSC1/2 19

84%) (213), залишаючи S6K2 занедбаним (214). Однак регуляція S6K2 подібна до S6K1, оскільки 7 з 8 місць фосфорилювання S6K1 зберігаються на S6K2 (215-217). 34

(345). Більше того, Rheb та AMPK нещодавно були визначені регуляторами мітофагії (115, 346, 347) (Малюнок 22). Малюнок 22: Мітофагія. Мітохондріальний динамізм включає кілька повторюваних циклів синтезу та поділу. Злиття мітохондрій регулюється MFN1/2 (обидва білки необхідні для злиття зовнішньої мембрани) та Opa1 (необхідне для злиття внутрішньої мембрани). Ділення мітохондрій регулюється Drp1, Mff та Fis1. Коли частина мітохондрій деполяризується, вона націлена на деградацію. Дефектна частина накопичує білок PINK1 на поверхні мітохондрій, який, у свою чергу, завербує Паркін. Останній, Паркін, індукує повсюдне поширення зовнішньої мембрани, що ініціює вербування аутофагосом, вміст яких погіршується після злиття з лізосомою. (Адаптовано до (342)) 1.8.4.4 Мітохондрії та ендоплазматичний ретикулум (ER) Мітохондрії взаємодіють на декількох рівнях з клітиною, щоб адекватно реагувати на різні зовнішні сигнали. Одним із способів взаємодії мітохондрій з клітиною є взаємодія з іншими органелами. Взаємодія, яка була найбільшою 59

Рисунок 27: Роль АФК як сигнальних молекул у контролі аутофагії під час голодування. Супероксид (O2) і H2O2 - це дві форми АФК, які в основному виробляються мітохондріями під час голодування. Вони позитивно регулюють аутофагію принаймні за трьома різними механізмами, включаючи (a) S-глутахіонілювання залишків цистеїну (SH S-SG), розташованих в α та β субодиницях AMPK, (b) окислення Cys81 (SH Sox) Білок Atg4, який інактивує деліпідацію LC-3, тим самим сприяючи накопиченню проавтофагічної форми LC3-II, (c) зміні окислювально-відновного статусу (приклад: зниження рівнів співвідношення GSH/GSSG, що збільшує окислення тіольних груп, Sox), що сприяє вивільненню відновленого глуатіону (GSH) у позаклітинному середовищі білком стійкості до лікарських засобів (MRP1). У той же час окислювальний стрес також може активувати повсюдне виділення 66

підвищений ділення. Цей стан пов'язаний зі зниженням біоенергетичної ефективності (посилення роз'єднання окисного дихання мітохондрій). Таким чином, оскільки біоенергетична адаптація до високого енергозабезпечення спричиняє зупинку життєвого циклу мітохондрій, високий та хронічний вплив поживних речовин знижує "якісний" контроль мітохондрій за допомогою мітофагії, що сприяє дисфункції мітохондрій. (Адаптовано з (389)) 71

Розділ I Передмова Метою дослідницького проекту було перевірити гіпотезу про те, що фармакологічне інгібування S6K1 покращить передачу сигналів про інсулін, його функцію та метаболізм глюкози на тваринній моделі ожиріння. Я є провідним автором цього дослідження, яке було опубліковане в журналі Diabetologia. Загальну концептуалізацію проекту здійснили доктор Андре Маретт та я. Клітинні дослідження були зроблені мною, крім ядерних екстракцій, щоб визначити рівні експресії факторів транскрипції, які проводив Кесртін Беллеман. Всі дослідження на тваринах були зроблені мною за допомогою Філіппа Сен-П'єра. Я зробив усі імуноблоти західного типу. Я провів статистичний аналіз, здійснив і зібрав цифри. Спочатку рукопис був написаний мною, доповнений Керстін Беллеман та Філіппом Сен-П'єром, нарешті, виправлений та вдосконалений доктором Андре Маретт. За підтримки доктора Андре Маретта я відповідав за подання статей та спілкування з арбітрами та редактором журналу. 76

Стаття Фармакологічне інгібування S6K1 підвищує метаболізм глюкози та передачу сигналів Akt in vitro та у мишей із ожирінням, індукованих дієтою. Майкл Шум, Керстін Беллман, Філіпп Сен-П'єр, Андре Маретт, Медичний відділ, Інститут серця та легенів Квебеку, Hôpital Laval, Pavillon Marguerite d ' youville, кімната Y4308, 2705 Chemin Ste-Foy, Квебек, Канада G1V 4G5 Автор-кореспондент: Андре Маретт, кафедра медицини, Квебекський інститут серця і легенів, Hôpital Laval, Pavillon Marguerite youville, кімната Y4308, 2705 Chemin Ste-Foy, Квебек, Канада G1V 4G5 Електронна пошта: [email protected] Отримано: 18 червня 2015 р./Прийнято: 13 листопада 2015 р. Diabetologia. 2016 р.; 59 (3): 592-603 77

Резюме Шлях mtorc/s6k1 переактивований при ожирінні, що призводить до гальмування шляху PI3K/Akt та індукції інсулінорезистентності. Таким чином, у цьому дослідженні ми використовували селективний інгібітор S6K1, PF-4708671, щоб визначити, чи може інгібування S6K1 покращити гомеостаз глюкози та резистентність до інсуліну. Ми використовували клітини м’язів L6 та печінкові клітини ФАО для вивчення метаболічних ефектів інгібування S6K1 на транспорт м’язової глюкози, вироблення печінкової глюкози та передачу сигналів інсуліну. Ми також лікували мишей, яких годували дієтою з високим вмістом жиру PF-4708671 протягом 1 тижня, щоб оцінити вплив інгібування S6K1 на метаболізм глюкози in vivo. Ми спостерігали, що інгібітор S6K1 викликав збільшення транспорту глюкози, зменшення вироблення печінкової глюкози в клітинах L6 та CAM, а також покращення толерантності до глюкози у мишей із ожирінням. Таким чином, ми припускаємо, що інгібування S6K1 є цікавою терапевтичною стратегією для лікування непереносимості глюкози у людей із ожирінням. 78

багатосайтове фосфорилювання у відповідь на агенти, що піднімають клітинний табір. Журнал біологічної хімії 281, 36662-36672 49. Rhim, JH, Jang, IS, Song, KY, Ha, MK, Cho, SC, Yeo, EJ, and Park, SC (2008) Збільшення інгібітора лізофосфатидної кислоти та аденилілциклази проліферація стареючих диплоїдних фібробластів людини шляхом інгібування активованої аденозинмонофосфатом протеїнкінази. Дослідження омолодження 11, 781-792 50. Шима, Х., Пенде, М., Чен, Ю., Фумагаллі, С., Томас, Г., і Козма, Південна Кароліна (1998) Порушення p70 (s6k)/p85 Ген (s6k) виявляє невеликий фенотип миші та нову функціональну S6-кіназу. Журнал EMBO 17, 6649-6659 51. Barger, JF, Gallo, CA, Tandon, P., Liu, H., Sullivan, A., Grimes, HL, and Plas, DR (2013) S6K1 визначає метаболічні вимоги до Виживання BCR-ABL. Онкоген 32, 453-461128

Легенди до рисунків Рисунок 1: PF-4708671 індукував поглинання глюкози в базальних м’язах і зменшував вироблення базальної глюкози в гепатоцитах. (A) Поглинання глюкози оцінювали в клітинах L6, як описано в матеріалах. Клітини обробляли 10 мкМ PF-4708671 протягом зазначеного часу з інсуліном або без нього (100 нм, 45 хв). Через 7 днів диференціації оцінювали поглинання 2-дезоксиглюкози шляхом інкубації клітин з [3H] -2-D-дезоксиглюкозою протягом 8 хв. Потім міоцити лізували і оцінювали концентрації білка, щоб нормалізувати радіоактивні показники. Результати представлені в базовому режимі в кратному розмірі і є середнім +/- SEM щонайменше 4 незалежних експериментів. (В) Вироблення глюкози в клітинах гепатоми ФАО вимірювали через 5 та 72 год обробки PF-4708671 або після обробки інсуліном (100 нм, 30 хв). Результати представлені в мкг глюкози на мкг білка. Показано середнє значення +/- SEM принаймні 4 незалежних експериментів. * стор