Розпізнавання ферменту-субстрату в реакціях згортання каталізованого білка - PDF Безкоштовно завантажити

Розпізнавання ферменту-субстрату в каталізованих реакціях згортання білка

згортання

Розпізнавання фермент-субстрату в каталізованих реакціях згортання білків Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора природних наук (Dr. rer. Nat.) Представлена ​​на факультеті природничих наук I Biosciences в Університеті Мартіна Лютера Галле-Віттенберг випускницею-хіміком Керолайн Хаупт, яка народилася 28 червня 1980 в Карлсбурзі Галле (Заале) 2009

Докторська заявка подана: 8 жовтня 2009 р. День наукового колоквіуму: 21 грудня 2009 р. Рецензент: (1) Проф. Мілтон Т. Стаббс (2) Проф. Йохен Бальбах (3) PD Dr. Йохен Рейнштейн

Справжній учений прислухається до розуму природи і бачить природу речей. Ентоні Г. Е. Блейк

Зміст 3.2.3. Підсумкове обговорення: локалізація сайтів зв'язування в SlyD * та характеристика активності шаперону. 103 3.3. Функція пептидилпролілізомерази SlyD *. 105 3.3.1. Значення мутації Y68W для каталітичного механізму проліл-ізомерази SlyD *. 105 3.3.2. ЯМР-дослідження в режимі реального часу для каталізування повторного складання RNase T1 (S54G/P55N). 107 3.3.2.1. 3D-ЯМР-спектроскопія для присвоєння кінетичного складчастого проміжного продукту РНКази T1 (S54G/P55N). 108 3.3.2.2. ЯМР-спектроскопічне відкриття другої конформації у природній РНКазі T1 (S54G/P55N). 111 3.3.2.3. Спостереження за каталізатором повторного згортання за серійно записаними 2D 1 H/15 N-TROSY-HSQC спектрами. 113 3.3.3. Підсумкове обговорення: ЯМР-спостереження в режимі реального часу за каталізатором SlyD * за допомогою перехідного складного проміжного продукту РНКази T1 (S54G/P55N). 119 4. Короткий зміст. 121 5. Резюме. 123 6. Список скорочень. 125 7. Бібліографія. 129 8. Додаток. 143 8.1. Ілюстрації. 143 8.2. Столи. 159 8.3. Імпульсні програми. 175 8.4. Макроси Фелікс. 191 9. Власні публікації. 193 10. CV. 194 11. Подяки. 195 III

Температура введення та каталітичні умови оптимізовані. Крім того, для цього питання необхідна розробка та адаптація методів ЯМР у реальному часі, які будуть використовуватися. Таким чином, метою даної роботи повинно бути молекулярне розуміння каталізу реакцій повільного згортання за допомогою PPIases, а також доменного зв'язку між шапероном та PPIase доменами SlyD *. 19-го

Зафіксовано розмірність матеріалів та методів. Тривалість спектру FHSQC становила 4 хв 52 с, і спектри оцінювали аналогічно титруванню ЯМР та аналізу хімічного зсуву за допомогою рівняння [2.14]. 59

Результати та обговорення відзначені. Гучність перехресних сигналів використовується для оцінки переходу розвитку. Зменшення обсягу спостерігається для крос-піків місцевих видів, а збільшення обсягу - для сигналів денатурованого виду з різним хімічним зсувом. Всього 93 амінокислотних залишків можна оцінити для природного стану (додаток, табл. 8-1). 3-6 1 H/15 N TROSY-спектри SlyD * під час індукованого сечовиною розгортання. Спектр SlyD * у вихідному стані при 0 M сечовини, B у незгорнутому стані при 5,5 M сечовини та C у середній точці переходу при 2,2 M сечовини. Перехід вимірювали в 50 мМ Na 2 HPO 4, 100 мМ NaCl, 10% D 2 O, рН 7,5 при 15 С і концентрації білка 0,67 мМ. Відповідна крива переходу для призначених перехресних сигналів показана на рис. 3-7. Деякі приклади перехресних сигналів, що показують криву переходу відповідно до моделі двох станів, показані на рис. 3-7. Залишки, поперечний пік яких становив 68

Результати та обговорення A B Рис. 3-14 H/D обмін SlyD *. A Фактори захисту магістральних амідних протонів SlyD * в логарифмічному графіку. Прямокутники являють собою вторинні конструктивні елементи, заповнені прямокутники означають β-аркуші, відкриті - для α-спіралей. B Ділянки високого (S> 10 4, синього) та низького коефіцієнтів захисту (10 2 S 10 4, блакитний), розміщені на структурі SlyD *. Коефіцієнти захисту розраховували за рівнянням [2.26]. Ділянки, в яких відповідні перехресні сигнали обмінялися протягом мертвого часу експерименту (40 хвилин), позначені сірим кольором. Непризначені залишки та проліни забарвлені в чорний колір. Амідний протонообмін для визначення реакцій швидкого обміну За допомогою модифікованої методики МЕКСИКО (Нова МЕКСИКА, 2.7.6.) Процеси обміну можуть визначатися за часове вікно від 10 мс до 250 мс. Для 47 амідних протонів, обмін яких з протонами розчинників неможливо виявити за допомогою H/D-обміну через нижчий захист, більш високі обмінні курси аналізували за допомогою New MEXICO у зазначеному часовому вікні. 3-15D показано відновлення намагніченості амідних протонів шляхом обміну поляризованими протонами води. 78

Результати та обговорення Рис. 3-15 Швидкий амідний протонообмін (Нова МЕКСИКА). Спектри A-C 1 H/15 N-FHSQC перед амідним протонообміном (еталон) та 60 мс або 250 мс після початку реакції обміну. D Кінетика обміну для вибраних амінокислотних залишків SlyD * при рН 7,5 і 15 С. Адаптація кінетики до моноекспоненціальної функції призвела до обмінних курсів 512 ± 5 с -1 (R95), 37 ± 3 с -1 (G86), 14 ± 2 с -1 (S40) та 12 ± 2 с -1 (Q102). Зазначені помилки виникають внаслідок адаптації до моноекспоненціальної функції. Оцінку реакцій обміну щодо термодинамічної стабільності можна проводити лише в тому випадку, якщо процес обміну протікає за механізмом EX2 (2.7.6). Через залежність від належності до механізму EX1 або EX2 новий експеримент MEXICO повторили з двома іншими значеннями ph (ph 6.0, ph 9.0). Перехід до діапазону EX1 можна спостерігати для 20 залишків при високому значенні рН. Вони опущені для термодинамічного розгляду. Фактори захисту та термодинамічну стабільність розраховували для решти 27 амінокислотних залишків згідно рівняння [2.26] (Додаток, табл. 8-8). 79

7,0 кДж/(м моль). Наявність IF-домену означає для SlyD * порівняно з ізольованим FKBP-доменом (SlyD * - IF, G U (H 2 O)

4,7 кДж/(м моль)) величезний приріст стабільності та значно підвищена кооперативність. Це також пояснює узгоджений розвиток обох доменів. SlyD * розгортається як кооперативний блок складання, в якому жоден з двох доменів не може бути локально розгорнутий, коли інший складений. За допомогою теорії рідкого стану водневого обміну також можна було б показати, що FKBP розгортається як одиниця з ІФ-доменом, оскільки не вдається виявити частково складених проміжних станів або складних субодиниць. У присутності Ni 2+ спостерігається значна термодинамічна стабілізація SlyD (1-155). Порівнюючи його з кристалічною структурою TtSlyD (Löw et al., 2009), можна було локалізувати ділянку зв’язування іона металу. Він розташований в останній α-спіралі (α3) домену FKBP в мотиві гістидину: His149-Gly150-His151-Val152-His153 в E.c.SlyD або His145-Gly146-His147-Ala148-His149 в TtSlyD. Ця остання α-спіраль є унікальною серед FK506-зв'язуючих білків і зустрічається лише у FKBP, гомологічних SlyD. Таким чином, він не тільки представляє новий структурний, але й новий функціональний елемент

Список скорочень 6. Список скорочень 1D, 2D, 3D, одно-, дво-, тривимірна A 280 нм AcCN Amp A.U. а.у. bp НАЙКРАЩИЙ BSA або c CD CsA C p δ MW G u (H 2 O) H u (T m) S u (H 2 O) n d [D] [D] 1/2 ddh2o ДНК DTT dyt ε E A E.c. (E. coli) EDTA ESI FID FKBP поглинання при 280 нм одиницях поглинання ацетонітрилу ампіциліну довільних одиниць пари базової пари (ДНК) смуга селективного збудження короткочасним бичачим бичачим сироватковим альбуміном (бичачий сироватковий альбумін) або концентрацією кругового дихроїзму циклоспорину Зміна теплоємності (ізобарний процес) означає зміну в хімічна зсувна вільна стабілізаційна ентальпія за відсутності денатурату зміна ентропії Ван Гоффа під час розгортання різниця показників заломлення товщина шару кювети (в дм) точка переходу концентрації денатурату в денатурантному розгортанні подвійно деіонізованій воді (залишкова провідність 0,055 мкСітіотрейтовая кислота (середовище триптонової кислоти) ) молярний коефіцієнт екстинкції енергія активації Escherichia coli етилендіамінтетраацетат електроспрей іонізація вільна індукція розпад FK505 зв'язуючий білок 125

Список скорочень FT GdmCl HCl HMQC hnoe HSQC Гц (МГц, ГГц) ЯКЩО INEPT IPTG ITC k 0 k cat k cat/KM k ch k cl KDK eq k int k kat KK KM k op N n NaOH NMR NOE NOESY M m (Новий) МЕКСИКА хв хв. Трансформація Фур'є гуанідиній хлорид соляна кислота гетероядерна багатоядерна квантова когерентність гетероядерний ефект NOE гетероядерна одноядерна одинарна квантова когерентність Герц (s -1) (Мегагерц, Гігагерц) підсилення нечутливих ядер, вбудованих у клапоть, за допомогою поляризаційного переносу ізопропіл-β-D-D-Dga-D-D-D-D-Dimo-D Швидкість некаталізованої реакції повторного згортання Швидкість обороту Каталітична ефективність ферменту Швидкість хімічного обміну Швидкість закриття Постійна дисоціації Постійна рівноваги Внутрішній обмінний обмін (визначається для модельних пептидів) Швидкість каталізованої реакції переплавлення Гідрофобний пептид із сигнальної пептидної послідовності HiPIP з двома лізинами замість аргініну натрієвої натрієвої натрієвої сталі Магнітний R esonance Nuclear Overhauser Enhancement Nuclear Overhauser Enhancement спектроскопія Молярна (моль/л) Вимірювання параметрів кооперативності швидких швидкостей обміну протонів у ізотопно мічених сполуках Хвилина не менше 126

Список скорочень MS Ni-IMAC OD P PCR PPIase ppm RCM-T1 RCM-α-La RNase T1 RR s SDS-PAGE SlyD SlyD * SOFAST SUMO T m Tat Tat27 TEMED TFA TFE TOCSY TPPI (Bis-) Tris TROSY U uu.u. UV VRR (v/v) WATERGATE WHP мас-спектрометрія Ni-ion метал спорідненість хроматографія фактор захисту оптичної щільності полімеразна ланцюгова реакція пептидил-проліл-цис/транс-ізомераза на мільйон відновлених і карбоксиметильованих RNase T1 відновлених і карбоксиметильованих α-лактальбуміну рибонуклеати T1 гідрофобіп-IPIP Сигнальна пептидна послідовність друга Натрію додецилсульфат поліакриламідний гель електрофорез чутливість до лізису D EcSlyD (1-165) смугово-селективний оптимізований короткочасний короткочасний температурний режим малого убіквітіноподібного модифікатора в центрі переходу сигнальна пептидна послідовність двійкового аргініну транслокон з CueO N, N, N, N -Тетраметилдіамін Трифтороцтова кислота Трифторетанол загальна кореляційна спектроскопія час пропорційне збільшення фази Трис- (гідроксиметил) амінометан поперечна релаксація оптимізована спектроскопія в розгорнутому стані, включаючи оберти в хвилину, можливо ультрафіолетовий гідрофільний пептид від обсягу послідовності пептиду HiPIP на об'єм ват пригнічення градієнтно-однотонним збудженням чудового білка, багатого гістидином 127

Список скорочень (в/в) YpSlyD напр. Вага на об'єм SlyD від Yersinia pestis, наприклад амінокислот, скорочувались звичайними одними або трьома літерними кодами. 128

Додаток 8. Додаток 8.1. Рисунки Рис. 8-1 Спектр випромінювання флуоресценції 5 мкм SlyD * у 50 мм Na 2 HPO 4, 100 мм NaCl, рН 7,5 при 15 С. Збудження відбувалося при 278 нм. Суцільна лінія являє собою власний стан, криву для розгорнутого стану Білок показано пунктирними лініями. Рис. 8-2 Індукований сечовиною перехідний перехід SlyD * -F84W. Виявлення переходу при 308 нм після збудження при 280 нм (трикутники), виявлення при 344 нм після збудження при 295 нм (кола). Суцільні лінії представляють адаптацію даних до моделі двох станів Отримані параметри стабільності (після збудження при 280 нм): GU (H 2 O) = 16,8 ± 0,7 кДж/моль, m eq = 6,8 ± 0,3 кДж/(м моль), [D] 1/2 = 2,5 М. Другий перехід, який показаний збільшеним у В, не може бути оцінений. Суцільна лінія лише для полегшення перегляду. Перехід вимірювали в 50 мМ Na 2 HPO 4, 100 мМ NaCl, рН 7,5 при 15 C. Концентрація білка становила 5 мкм. 143

Додаток Рис. 8-3 Індукований сечовиною розвиток переходу від SlyD * - IF. Розгортається перехід від SlyD * (відкриті символи) та SlyD * - IF (закриті символи). Суцільні лінії являють собою адаптацію даних до моделі з двома станами Отримані параметри стабільності для SlyD *: GU (H 2 O) = 18,4 ± 0,6 кдж/моль, m eq = 6,9 ± 0,2 кдж/(м моль), [D] 1/2 = 2,7 М, а для SlyD * - ПІК: GU (H 2 O) = 13,9 ± 0,5 кДж/моль, m екв. 3,2 ± 0, 1 кДж/(м моль), [D] 1/2 = 4,3 М Переходи вимірювали в 50 мм Na 2 HPO 4, 100 мм NaCl, рН 7,5 при 15 С. Концентрація білка становила 5 мкм. Рис. 8-4 Дані ізотермічної титрувальної калориметрії двох гомологічних SlyDs з Ni 2+. Інтегровану кількість тепла будували за співвідношенням концентрації ліганд/білок. У кожному випадку можна спостерігати дві події зв'язування, але адаптація даних до відповідної моделі зв'язування була неможлива через взаємопов'язані процеси. Ізотермічне титрування 18 мкм TtSlyD-His 6 з 270 мкм NiCl 2 (у 10 мМ Трис, рН 25 C 7,5, 25 C). B Ізотермічне титрування 16 мкм Е. SlyD (1-165) -His 6 з 240 мкм NiCl 2. 144

Додаток Рис. 8-5 Криві ізотермічного титрування калориметрії TtSlyD з Co 2+, Gd 3+ та Zn 2+. На верхньому малюнку зображена електрична потужність, яка була виявлена ​​після кожного введення відповідного іона металу. На малюнку нижче інтегральна кількість тепла нанесена на графік щодо відношення концентрації іонів металу/TtSlyD. Термодинамічні параметри були отримані з нелінійного пристосування до експериментальних даних на моделі зв'язування з сайтом зв'язування. Ізотермічне титрування 27 мкм TtSlyD з 270 мкм CoCl 2 (у 10 мМ трис, рН 25 C 7,5, 25 C). Ентальпія реакції, що виділяється при зв'язуванні, становила -13,2 ± 0,2 ккал/моль; константа спорідненості становила 2,4 ± 0,2 х 10 6 М -1. Це призвело до значення K D 420 нм. Дані, показані червоним кольором, відповідають титруванню TtSlyD з GdCl 3. Жодного зв'язування Gd 3+ неможливо визначити. B Ізотермічне титрування 27 мкм TtSlyD з 270 мкм ZnCl 2 (у 10 мМ трис, рН 25 C 7,5, 25 C). Ентальпія реакції, що виділяється при зв'язуванні, становила тут -10,0 ± 0,1 ккал/моль; константа спорідненості становила 9,8 ± 1,5 х 10 6 М -1. Отримане значення K D становило 102 нм.145

Додаток Рис. 8-6 ЯМР титрування 15 N-SlyD * з нативною РНКазою T1 (S54G/P55N) у 50 мм Na 2 HPO 4, 100 мМ NaCl, рН 7,5 при 25 С. Заснована зміна хімічного зсуву деяких поперечних піків про неспецифічні взаємодії неструктурованої С-кінцевої частини та мітки His 6. Рис. 8-7 Титрування Tat27 флуоресценцією Tat27 з SlyD * у 50 мм Na 2 HPO 4, 100 мМ NaCl, рН 7,5 при 25 С. Суцільна лінія відповідає адаптації до простої моделі зв'язування з одним сайтом зв'язування. Стехіометрія 1 призводить до константи дисоціації 0,5 ± 0,1 мкм. Амінокислотна послідовність пептиду Tat: QRRDFLKYSVALGVASALPLWSRAVFA. 146

Додаток Рис. 8-8 Титрування 15 N-SlyD * з RCM-T1. Залежність зміни хімічного зсуву від відношення концентрації RCM-T1 до SlyD * (A) та від концентрації субстрату RCM-T1 (B) для двох амідних протонів D88 та S26 від титрування ЯМР. A Крива рівноваги прив'язки отримується з лінійної посадки. Точка еквівалентності становить близько 1 і вказує на комплекс 1: 1. B Суцільні лінії призначені лише для очей, але не мають фізичного значення. C Титрування RCM-T1, виявлене флуоресценцією, за допомогою SlyD *. Суцільна лінія відповідає адаптації до простої моделі зв’язування з точкою прив’язки. Стехіометрія 1 призводить до константи дисоціації 4,4 ± 0,8 мкм. Обидва титрування проводили в 50 мМ Na 2 HPO 4, 100 мМ NaCl, рН 7,5 при 25 С. 147

Додаток Рис. 8-9 Спектр 1 H/15 N-FHSQC ізольованого домену IF у присутності 0,5 M (NH 4) 2 SO 4 при 25 C. Перехресні піки розгорнутих видів в основному знаходяться в середині Спектр при 7,8 - 8,4 ppm. Інтенсивність дисперсних сигналів структурованих видів становить приблизно 30%. Рис. 8-10 Послідовність спектрів 1D 1H 450 мкм інсуліну після початку реакції агрегації при 25 ° С додаванням DTT. Показано область низького поля з кількома сигналами від амідних протонів ланцюга А. 148

Додаток Рис. 8-13 1 H/15 N-гетероядерний NOE при 14,2 Т і 25 C для SlyD * (чорний) і SlyD * -Y68W (червоний). Різну динаміку двох доменів у двох білках можна чітко побачити на шкалі наносекундного ЯМР пікобіса; домен IF набагато гнучкіший, ніж домен FKBP. У районі навколо W68 мутант демонструє посилену динаміку. Дані про хно люб’язно надав Майкл Коверманн. Рис. 8-14 Термодинамічна стабільність SlyD * щодо GdmCl. Індукований GdmCl перехід розвитку SlyD * у 10 мм Tris, ph 20 C 7,5 при 20 C (A) та у 10 mm Bis-Tris, ph 10 C 6,0 при 10 C (B). Суцільні лінії представляють адаптацію даних до двоступеневої моделі з наступними параметрами стабільності: GU (H 2 O) = 15,3 ± 1,4 кДж/моль, m eq = 13,7 ± 1,1 кДж/(м моль) і [D] 1/2 = 1,1 М (ph 7,5, A) або GU (H 2 O) = 12,0 ± 0,8 кДж/моль, m eq = 13,0 ± 0,6 кдж/(м моль) та [D] 1/2 = 0,9 М (рн 6,0, В). Концентрація білка становила 2 мкм (А) та 5 мкм (В). Помилки виникають внаслідок узгодження даних із рівнянням [2.10]. 150

Додаток 10 9 8 7 6 5 1 H (ppm) Рис. 8-15 1 H-спектри SlyD * у 10 мм Tris, ph 20 C 7,5 у присутності GdmCl. Низька роздільна здатність та інтенсивність сигналу в присутності GdmCl (0,4 М GdmCl (червоний спектр) і без GdmCl (синій спектр)) можна чітко помітити. 151

Додаток Рис. 8-16 діаграма з перекладом RNase T1 (S54G/P55N). Послідовність спектрів 1D 1H 1,9 мм РНКази T1 (S54G/P55N) за відсутності (A) та присутності 190 мкм SlyD * (B). Показана область низького поля з амідною протонною областю. Часова роздільна здатність на спектр становила 5 хв 21 с, оскільки для покращення співвідношення сигнал/шум усереднено чотири послідовні спектри. 152