ТЕЗИ. отримати ступінь: доктор матеріалознавства, фізики, хімії та нанонауки в університеті Екс-Марселя
Екс-Марсельський університет Номер замовлення: ТЕЗ для здобуття наукового ступеня: доктор матеріалознавства, фізики, хімії та нанознавства Екс-Марсельського університету Розробка універсального мікрофлюїдного інструменту для вивчення кристалізації: застосування до зародження основних фармацевтичних діючих речовин Представлено Автор: Мануель ІЛДЕФОНСО. Буде публічно підтриманий у п’ятницю, 29 червня, перед журі: Доповідачі: пані Фабієн ЕСПІТАЛЬЄР РАПСОДІ Альбі UMR 5302 Пан Франсуа ПУЕЛ ЛАГЕП Ліон UMR 5007 Ревізори: Пан П'єр БОНГРАНД ЛАЙ Марсель Інсерм U1067 LETELLIER TECHNOLOGIE SERVIER Орлеан Пан Аластер МАГНАЛЬДО CEA-Маркуль Баньоль-сюр-Сез Пані Ен СПАСОЄВІЧ SPMS Шатеней-Малабрі UMR 8580 Керівники дипломних робіт: Пані Надін КАНДОНІ КІНАМ Марсель УМР 7325 МЕС Мерсейн УМР 7325 Пан Марсель ВМР 7325 м. de Nanosciences de Marseille CINaM-CNRS (UMR 7325) Campus de Luminy, Case 913, 13288 Marseille Cedex 9 1
Подяки [] Бути щасливим самотужки може бути соромно. Альбер Камю, Чума 2
Зміст Пильно спостерігати - це чітко пам’ятати Едгара По, Надзвичайні історії 5
2 ДО ВИВЧЕННЯ НУКЛЕКЦІЇ В ОРГАНІЧНІЙ ФАЗІ (СТАТТЯ 3). 86 2.1 УНІВЕРСАЛЬНА СИСТЕМА ЗБЕРІГАННЯ. 86 2.1.1 Спосіб зберігання крапель у тефлонових капілярах. 87 2.1.2 Межа метастабільної зони. 88 2.1.3 Частота зародження. 89 2.2 ДО УНІВЕРСАЛЬНОЇ МІКРОФЛЮЇДИЧНОЇ СИСТЕМИ, СУМІСНОЇ З БУДЬ-ЯКИМ РОЗЧИННИКОМ І БУДЬ-ЯКОЮ МОЛЕКУЛОЮ 93 2.2.1 Фабрика вилок на основі капілярів. 93 а) Завод штекерів на основі введення голки в капіляр. 93 б) Завод штекерів на основі методів ВЕРХ. 94 в) Вибір масла, що впорскується на заводі, що працює на штекери D) Інжекторний інструмент на заводі з виробництва штекерів. 95 2.2.2 Перевірка нового заводу. 96 а) Валідація утворення крапель різних розчинників. 96 б) Підтвердження зберігання крапель різних розчинників. 96 в) Перевірка експериментів кристалізації в різних розчинниках. 97 2.2.3 Доцільність вимірювання LZM кофеїну. 98 2.3 СТАТТЯ 3.100 ЗАГАЛЬНИЙ ВИСНОВОК. 106 ДОДАТКИ. 110 1 ЖИТТЯ. 111 2 КРИСТАЛІЗАЦІЯ KDP. 114 3 НАНОТЕХНОЛОГІЇ, ПРИСВІЧЕНІ КОНТРОЛЮ ЯДЕРНОСТІ. 123 БІБЛІОГРАФІЯ. 146 7
Малюнок 57: Діаграма виробництва крапель у поперечних з'єднаннях (а) (б) у Т. Жовтим - надходження масла FC-70, синім - надходження розчину та пунктирними лініями вихід крапель. 94 Рисунок 58: Формування крапель у переході Т. 95 Рисунок 59: Структурна формула FC-70. 95 Рисунок 60: Фотографія крапель, що містять кристали, у новій мікрофлюїдній системі на основі капілярної техніки: (а) кристал лізоциму 30 мг/мл при 20 С у водному буфері 0,7 М NaCl ph = 4,5; (b) кристал кофеїну в етанолі 7 мг/мл при 20 С; (c) кристал ізонікотинаміду в етанолі 143 мг/мл при 10 С; (d) Кристал ізонікотинаміду в нітробензолі 7 мг/мл при 10 C. 97 Рисунок 61: Кристали кофеїну в краплі 250 нл 7 мг/мл при 20 C. 98 Рисунок 62: Розчинність та LZM кофеїну в етанолі за температурної функції. 99 11
Вступ "Я називаю все, що має початок, середину і кінець. Початок - це те, що нічого не передбачає перед собою, але що хоче чогось після". Арістотель 12
Розділ 1: Бібліографія Якщо ви не можете пояснити поняття шестирічному віку, ви його не повністю розумієте. Альберт Ейнштейн 16
Рисунок 1: Схематичне зображення основних типів фацій 5 Фація відіграє важливу роль у макроскопічній поведінці кристалічного порошку. Наприклад, порошок, що складається з безлічі голок, утворює агрегати легше, ніж порошок, складений з кубиків. Після цих кількох нагадувань про кристалізацію в розчині ми можемо детально описати явища поліморфізму та зародження, які нас особливо цікавлять у цій роботі. 19
Нарешті, інша система наближається до наших цілей, оскільки це мікрорідка система, призначена для кристалізації органічних молекул в органічних розчинниках 33, розроблена Teychené et al. Однак, такі полімери, як PDMS, не сумісні з органічними розчинниками, автори були змушені виготовляти мікрофлюїдний чіп у склі. Однак скло має дефект гідрофільності, що означає, що безперервною фазою для утворення крапель повинна бути вода, тоді як певні органічні розчинники, що використовуються для кристалізації активних фармацевтичних інгредієнтів, змішуються з водою. Таким чином, у разі часткової змішуваності розчинник дифундує у воду, зменшуючи розмір краплі. Якщо змішуваність завершена, формування крапель стане неможливим. Таким чином, цей мікрофлюїдний чіп дозволяє визначити частоту зародження в органічних розчинниках, які не змішуються з водою, а використання скла як матеріалу робить його виготовлення дорогим та складним. 39
Кожен з представлених вище мікрорідких методів має переваги та недоліки. Однак виділяються дві методики: - м’яка літографія для виготовлення мікросхем PDMS, що дозволило розвивати дослідження мікрофлюїдів у великій кількості лабораторій. - використання мікрофлюїдних систем на основі капілярів, що дозволяє неспеціалістам у мікрофлюїдиці швидко розробляти прості мікрофлюїдні засоби. На закінчення ми можемо побачити, що зростаючий інтерес до мікрофлюїдики з боку дослідників з самих різних областей призвів до швидкого розвитку застосувань, а також методів виробництва мікрофлюїдних систем. Це дозволило зменшити виробничі витрати і, отже, розширити сферу потенційних застосувань. Однак ці технології є ще зовсім недавніми, і тому, як очікується, значно розвиватимуться протягом наступних кількох років. Нарешті, мікрофлюїдним технологіям залишається знайти своє місце поряд з іншими лабораторними методами. 45
Розділ 2: Матеріали та методи "Не покладайтесь повністю на теорію, коли на кону ваше життя". Френк Герберт 46
10 9 8 Концентрація (у мг/мл) 7 6 5 4 3 2 1 0 20 25 30 35 40 45 50 Температура (в С) Рисунок 29: Принципова схема розрахунку максимального перенасичення, доступного в діапазоні температур від 25 С до 45 С. Етилацетат Етанол Дихлорметан Ацетон Розчинність 25 С 70 мг/мл 4 мг/мл 120 мг/мл 11 мг/мл Розчинність 45 С 110 мг/мл 9 мг/мл 140 мг/мл 16 мг/мл Перенасичення 1,57 2,25 1,25 1,45 45 C 25 C Таблиця 1: Розчинність кофеїну при 25 C і 45 C у різних розчинниках і перенасичення між 45 C і 25 C. З даних таблиці 1 ми вибрали етанол як розчинник та етилацетат. Вони обидва є звичайними розчинниками для стадії кристалізації у фармацевтичній галузі. Розчини кофеїну готують гарячим розчиненням необхідної кількості кофеїну в розчиннику. Потім відбувається перенасичення, охолоджуючи розчин кофеїну. 50
Розділ 3: Результати та обговорення «Те, що важливо, не завжди можна підрахувати, а те, що можна підрахувати, не завжди». Альберт Ейнштейн 60
Ця система має перевагу в тому, що вона створює краплі, що надходять від одного заводу, і, отже, всі однакові за обсягом і концентрацією, і в тому, що їх можна зберігати в різних чіпах для зберігання. Потім кожен накопичувальний чіп зберігається в печах при різних температурах. Тому можна одночасно перевірити кілька температур кристалізації. Щоб перевірити багаторазові концентрації лізоциму, необхідно змінити концентрацію в розчині лізоциму, що подається на завод, що виробляє штекери. Таким чином, ми отримуємо точки при різних температурах і різних концентраціях. 64
1.5 Стаття 1 Зародження та поліморфізм досліджуються за допомогою простого у використанні мікрофлюїдного інструменту М. Ільдефонсо, Е. Ревалор, П. Пунніам, Дж. Б. Салмон, Н. Кандоні та С. Вееслер Journal of Crystal Growth, 2012, 9-12 У цій статті ми представляємо два основні результати: 1) проста у використанні мікрорідка система, яку можна легко перенести в немікрофлюїдну лабораторію; 2) точний метод вимірювання межі метастабільної зони. Ми визначаємо область фазової діаграми, де зародження, швидше за все, буде одноядерним, тобто на краплю припадає не більше одного кристала. Крім того, нам вдалося заробити та стабілізувати кристал з метастабільною фазою. Цей мікрофлюїдний підхід є дуже перспективним з точки зору як контролю, так і вивчення процесів кристалізації. 76
1.6 Стаття 2 Використання мікрофлюїдів для швидкого, точного вимірювання кінетики зародження лізоциму М. Ільдефонсо, Н. Кандоні та С. Вееслер Ріст та дизайн кристалів, 2011, 11 (5), 1527-1530 Короткий зміст: У цій статті ми вимірюємо кінетику зародження лізоциму з використанням простої у використанні та виробництві мікрорідкої системи, описаної в попередній статті. Таким чином, ми підтверджуємо, що мікрофлюїдики є прямим, точним і швидким засобом вимірювання частоти нуклеації, використовуючи лише кілька міліграмів продукту. Крім того, наша мікрорідка система дозволяє, завдяки зменшенню обсягів кристалізованого розчину, розширити діапазон перенасичення, доступний експериментально. Нарешті, цю систему можна застосувати для вивчення кристалізації всіх типів молекул, розчинних у воді. 81
Для високих пересичених типів сховища мало впливає на частоти зародження. Така поведінка, ймовірно, зумовлена зменшенням гетерогенного зародження у випадку тефлону, як ми пояснили для кривої LZM. Потім ми можемо вивчити фактор ƒ далі. Дійсно, це дозволить нам кількісно порівняти неоднорідність зародження між двома методами зберігання. Для цього ми обчислюємо співвідношення ƒ тефлон/ƒ PDMS, використовуючи метод, подібний до розрахунку γ, що застосовувався раніше на сторінці 74, додаючи коефіцієнт ƒ. J = K 0 exp 16π f 3 Рівняння 9 2 3 Ω γ () 3 2 kt ln β J: Частота нуклеації (у м -3 с -1) K 0: Кінетичний коефіцієнт, характерний для пари кристалічного розчину (у м - 3 s -1) k: константа Больцмана 1.3806503.10-23 JK -1 T: Температура (у K) Ω: Об’єм молекули розчиненої речовини (у м 3) β: Перенасичення (без одиниць) γ: Середній агрегат/розчин міжфазної енергії ( Jm -2) ƒ: Параметр, що описує вплив субстрату на нуклеацію (0 1,9 до виникнення нуклеації (проти β> 1,03 для флаконів по 1 мл). Невеликий розмір крапель забезпечує доступ до пересичених речовин, яких не вдалося досягти іншими методи.
Мікрофлюїдний підхід в ПДМС моєї дипломної роботи доповнює це дослідження на дуже малих обсягах, показуючи простий метод, що дозволяє генерувати велику кількість крапель невеликого розміру. Більше того, завдяки кількості доступних крапель можна провести більш поглиблене вивчення явищ зародження шляхом вимірювання межі метастабільної зони або частоти зародження. Ця стаття дозволяє мені поставити свою роботу в контексті досліджень, проведених в лабораторії, а також показати узгодженість різних підходів, що використовуються для вивчення зародження. 124