УНІВЕРСИТЕТНА КЛІНІКА ГАМБУРГ-ЕПЕНДОРФ - PDF скачати безкоштовно

УНІВЕРСИТЕТНА КЛІНІКА ГАМБУРГ-ЕПЕНДОРФ Інститут клітинної та інтегративної фізіології Центру експериментальної медицини проф. мед. Хеймо Емке Роль кіназ WNK у регуляції транспорту електролітів у дистальному нефроні нокаутованої миші BKβ1 Дисертація На здобуття наукового ступеня доктора стоматології на медичному факультеті Гамбургського університету, представленої Аннелен Діттмер з Буххольца і.д.н. Гамбург 2013

університетна

Прийнято медичним факультетом Гамбургського університету 13 травня 2014 р. Опубліковано з дозволу медичного факультету Гамбургського університету. Екзаменаційна комісія, голова: проф. мед. Екзаменаційна комісія Х. Емке, другий рецензент: PD Dr. вип. нац. Е.Шведгельм Екзаменаційна комісія, третій рецензент: PD Dr. мед. К. Мейєр-Швезінгер

Зміст Зміст 1. Вступ 7 1.1 Артеріальна гіпертензія у зв'язку з прийомом натрію. 7 1.2 Транспортні системи натрію та калію в нирках 9 1.3 Синдром Гордона: Виявлення ролі кіназ WNK у регуляції артеріального тиску. 17 1.4 WNK-кінази ... 18 1.5 Вплив WNK-кіназ на електролітний баланс. 20 1.6 Мета та підхід у роботі. 25 2. Матеріал і методи. 27 2.1 Матеріал 27 2.1.1 Загальне лабораторне обладнання 27 2.1.2 Витратні матеріали. 29 2.1.3 Хімічні речовини. 30 2.1.4 Ферменти 31 2.1.5 Біохімія 32 2.1.6 Набір . 33 2.1.7 Розчини, буфери 33 2.2 Методи. 36 2.2.1 Дієта тварин на калії. 36 2.2.2 Захисні заходи щодо виділення РНК. 37 2.2.3 Розсічення нирки та виділення РНК ниркової зони. 37 2.2.4 Вимірювання OD ізольованої РНК нирки 39 2.2.5 Вимірювання Agilent ізольованої РНК нирки 39 2.2.6 Мікродісекція 40 2.2.7 Виділення РНК канальців нефрону. 41 2.2.8 Зворотна транскриптаза (RT) . 42 2.2.9 Актин-ПЛР.43 4

Зміст 2.2.10 Електрофорез у агарозному гелі.44 2.2.11 ПЛР у режимі реального часу.44 2.2.12 Статистика. 49 3. Результати 51 3.1 Порівняння мишей нокауту дикого типу та BKβ1 51 3.1.1 Результати ПЛР-аналізу в реальному часі ділянки кори . 51 3.1.2 Результати ПЛР-аналізу в реальному часі мікродисекції 55 3.2 Результати калієвих дієт. 58 3.2.1 Просвітній транспортер натрію NCC та епітеліальний натрієвий канал ENaCβ на калієвій дієті 58 3.2.2 Верхівковий калієвий канал ROMK на калієвій дієті 61 3.2.3 Кінази WNK на калієвій дієті 62 3.2.4 Кіназа SGK1 та білок GRP58 на калієвій дієті. 64 3.2.5 Білок CHIF на калієвій дієті 66 3.2.6 Транспортер NKCC2 на калієвій дієті. 67 4. Обговорення 68 4.1 Мотивація запитання 68 4.2 Миші дикого типу на калієвій дієті ... 69 4.2.1 Котранспортер натрію хлориду (NCC) 72 4.2.2 Епітеліальний натрієвий канал (ENaC). 72 4.2.3 Просвітній калієвий канал ROMK 73 4.2.4 Поведінка кіназ 75 4.2.5 Інші можливі мішені альдостерону 79 4.3 Порівняння мишей нокауту дикого типу та BKβ1. 82 4.3.1 Результати ПЛР у режимі реального часу за нормальної дієти 82 4.3.2 Результати мікродисекції 84 4.4 Миші BKβ1, що нокаутують на калієвій дієті ... 85 5

Зміст 4.4.1 Дієта з низьким вмістом калію у нокаутованих мишей BKβ1. 85 4.4.2 Багата калієм дієта у нокаутованих мишей BKβ1 . 88 4.5 Перспектива. 90 5. Резюме 93 6. Список скорочень. 94 7. Список малюнків. 98 8. Список таблиць. 101 9. Бібліографія. 102 10. Подяки. 119 11. CV. 120 12. Свідчення . 121 6

Матеріал і методи 2. Матеріал і методи 2.1 Матеріал 2.1.1 Загальні лабораторні прилади Таблиця 1a: Загальні лабораторні пристрої, що використовуються Позначення типу пристрою Вага аналізу компанії ISO 9001 Sartorius AG, Геттінгенський автоклав 3850 ELC Tuttnauer Systec Ltd., Нью-Йорк, США Біоаналізатор типу 2100 Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія, США Електрофорез Блок живлення EPS 600 Pharmacia Biotech GmbH, Фрайбург Скляна піпетка Піпетна батарея Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co KG, Еберштадт Електрофорезна камера Політронний гомогенізатор ПЛР-пристрій Тиристорний контролер TR50 Генна підсилювальна система ПЛР 2400 Janke & Kunkel, IKA-Werke, Wilmington, Нью-Джерсі, США Perkim Elmer, Norwalk CT, США ph-метр ph-метр 320 Mettler-Toledo GmbH, Гіссенський фотометр Ultrospec 3000 Pharmacia Biotech GmbH, Фрайбурзькі піпетки Pipetman P2, P10, P20, P200, P1000 Gilson, Middleton, WI, США 27

Матеріал і методи Таблиця 1b: Використовуване загальнолабораторне обладнання Позначення типу пристрою Компанія Точні ваги 440-33N Готтл. Kern & Sohn GmbH, Балінген-Фроммерн ПЛР-пристрій у режимі реального часу Light Cycler гусяча лампа KL 1500 LCD Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Schott AG, Mainz Speed ​​Vac Concentrator 5301 Eppendorf AG, Hamburg Thermoblock TB1 Biometra GmbH, Göttingen Thermomixer 5436 Eppendorf AG, Hamburg Стіл для ультрафіолетового світла - Biometra GmbH, Göttingen Vortexer MS2 Minishaker Janke & Kunkel, IKA-Werke, Wilmington, NJ, USA Центрифуга Центрифуга 5417C Eppendorf GmbH, Гамбург Центрифуга 5417R Біофуга піко Biofuge stratos Eppendorf GmbH, Heraeus Instruments GmbH Heraeus, Instruments GmbH Остерод 28

Матеріал та методи 2.1.2 Витратні матеріали Таблиця 2: Використані витратні матеріали Матеріал Позначення продукту Компанія Випускні піпетки Серологічна піпетка 10 мл Falcon, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, США Наконечники піпеток Наконечники безпечного ущільнення: 10 мкл, 20 мкл, 100 мкл, 200 мкл, 1000 мкл Biozym Biotech Trading GmbH, Відень, Австрія Мікрореакційні посудини 1,5 мл Sarstedt AG, Nümbrecht 2 мл Sarstedt AG, Nümbrecht ПЛР-капіляри в реальному часі ПЛР-пробірки 0,2 мл Safe-Lock пробірки 0,5 мл для Agilent Light Cycler Capillaries (20 мкл) Eppendorf AG, Hamburg Eppendorf AG, Hamburg Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Tubs Cellstar 50 мл Greiner bio-one GmbH, Кремсмюнстер, Австрія Центрифужні пробірки Трубки 4 мл Sarstedt AG, Nümbrecht 29