Виявлення взаємодії білків та характеристика білкової функції за допомогою технології HaloTag

Резюме

Технологія HaloTag - це багатофункціональна технологія, яка продемонструвала значний успіх у виділенні малих та великих білкових комплексів із клітин ссавців. Тут ми виділяємо переваги цієї технології порівняно з існуючими альтернативами та показуємо її корисність для вивчення численних аспектів функціонування білка в еукаріотичних клітинах.

Анотація

Вступ

Розуміння клітинної функції, реакції на подразники та зміни станів розвитку та/або захворювань тісно пов’язане зі складанням протеомів у цих різних динамічних станах 1,2. Багато зроблено для розуміння протеомів нижчих організмів, але, враховуючи кількість білків та всі можливі взаємодії, це стало дуже складною справою з людським протеомом 1, 3–7. Досягнення мас-спектрометрії значно дали можливість проводити ці дослідження, і тут ми представляємо додатковий і значний прогрес у розробці технології HaloTag як для ефективного виявлення білкових комплексів, так і для функціональної характеристики білків людини з клітин ссавців 8-10. Ця технологія нещодавно була продемонстрована в кількох дослідженнях як важливий фактор у виявленні важливих взаємодій, що дозволяє зрозуміти нову функцію білка та зрозуміти захворювання 11-13.

Тут ми представляємо протоколи розкриття та візуалізації, застосовані до двох ключових терапевтичних білків, білка бромодомен BRD4 та гістондеацетилази, HDAC1 17. На цих прикладах ми показали взаємодію з партнерами, як очікувалося за допомогою мас-спектрометрії, ферментативну активність після складної ізоляції для HDAC1 та правильну клітинну локалізацію для обох. Разом ці результати демонструють багатофункціональну природу та силу методики для характеристики взаємодії та функції еукаріотичних білків.

Протокол

Примітка: Наступний протокол можна використовувати з будь-яким злиттям HaloTag і в будь-якій вибраній клітинній лінії, стабільно або тимчасово трансфікованій. Для цих прикладів ми пропонуємо протоколи транзиторної трансфекції злиття HaloTag у клітини HEK293T або HeLa. Для всіх експериментів ми рекомендуємо використовувати лише контрольний білок.

1. Тест на експресію злитого білка

3. Клітинна візуалізація флуоресцентно мічених злитих білків із використанням цитоплазматичної та ядерно-проникної ліганди

  1. Трансфекція, позначення та клітини зображення:
    1. У 8-лункові камерні покривні склянки для кожного злитого білка або контролю викладають 400 мкл клітин HeLa у відповідні середовища в кожну лунку при щільності 1-2 х 105 клітин/мл.
    2. Інкубуйте протягом 18-24 годин при 37 ° C і 5% CO 2, потім трансфектуйте, як рекомендується.
    3. Через 18-24 години після трансфекції розведіть TMR Ligand 1: 200 у відповідних клітинних середовищах, потім додайте 100 мкл цього розчину в кожну лунку та обережно перемішайте.
    4. Інкубуйте трансфіковані клітини, що містять ліганди, протягом 15 хвилин при 37 ° C і 5% CO 2.
    5. Аспіруйте ліганди середовища та замініть їх на 500 мкл відповідного середовища, яке містить відсутні ліганди злиття білка, які були нагріті до 37 ° C
    6. Повторіть двічі загалом три миття.
    7. Помістіть клітини назад в інкубатор (376, C і 5% CO 2) на 30 хв.
    8. Відсмоктуйте середовище та замінюйте 500 мкл відповідного середовища, нагрітого до 37 ° C
    9. Зображення на мікроскопі з відповідними параметрами отримання (TMR-збудження: 555 нм, випромінювання: 585 нм).

Репрезентативні результати

При роботі з будь-яким новим злитим білком важливо спочатку перевірити експресію білка після трансфекції, а також підтвердити, що виробляється білок правильної молекулярної маси. Оскільки злиті білки HaloTag можуть бути флуоресцентно та ковалентно мічені проникними або, залежно від локалізації, непроникними лігандами, можна швидко визначити експресію шляхом денатурації клітинних лізатів за допомогою гель-електрофорезу з подальшим скануванням на флюоримагері. Використовуючи розділ 1.2, роздрукуйте Halo BRD4 (189 кД) та контрольний HaloTag (Ctrl), який спостерігали (34 кД), 2А) описаний протокол. Як згадується в протоколі, експресія злитих білків також може бути виявлена ​​за допомогою звичайних вестерн-блотів з антитілами HaloTag або, якщо вони є, антитілами до білка приманки. Якщо це можливо, рекомендується використовувати флуоресцентний ліганд замість нього, оскільки він є більш точним, швидшим і простішим, ніж виявлення антитіл, а також кількісний 10.

Ізольовані комплекси також можна досліджувати на активність; Рекомендується елюювати комплекси протеазою TEV (розділ протоколу 2.5), щоб вони зберігали свої функціональні можливості. В Малюнок 3А Показано фарбування сріблом гелевих розпадаючих комплексів Halo-HDAC1, що виділяються із смоли з використанням протеази TEV. Як протеаза TEV, значні кількості білка приманки, в даному випадку HDAC1, спостерігаються в області зв'язування між злитим білком Tag та його партнером по злиття. (Рис. 3A) розділити. Щоб визначити, чи має ця фракція активність HDAC1, елюйовані зразки TEV тестували в люмінесцентному аналізі HDAC HDAC-Glo 21. Як і в 3B Як показано, збірні зразки HDAC1 показали високу активність HDAC1 (колонка 1), яка була спеціально інгібована відомим інгібітором HDAC, SAHA 22 (колонка 2). В якості контролів для подальшої демонстрації специфічності не спостерігалося інгібування HDAC із спорідненим сімейним інгібітором сиртуїну, EX-527 22 (колонка 3), і не було виявлено жодного сигналу лише за допомогою буфера без датчика випадання HDAC1 (колонка 4).

Суттєвою частиною функціональної протеоміки та розуміння комплексів є також розуміння локалізації білка та/або торгівлі людьми. Оскільки ці самі конструкції злиття можна флуоресцентно мітити в клітинах, ми контролювали їх локалізацію за допомогою конфокальних зображень. Відповідно до протоколу, наведеного в Розділі 3, клітини HeLa стали транзиторними з Halo-BRD4 (4А) та Halo-HDAC1 (4В) трансфікований флуоресцентно мічений лігандом TMR і візуалізується. Як і в 4А і 4В показано, що локалізовано як в ядрі, як очікувалося 17. Ці дані вказують на те, що наявність мітки не змінює фізіологічну клітинну локалізацію партнера по зрощенню.

виявлення
Рисунок 1. Схема застосувань білків, що розпадаються, та конфокальних зображень. Застосовуючи його як конструкцію укусу, можливо кілька програм для розуміння функції білка в клітинах ссавців. Зрештою, конструкція злиття гало гало або стабільно, або тимчасово експресується в приклеєних або суспензійних клітинах ссавців. Для витягування білкових комплексів клітини лізують, комплекси ковалентно захоплюють на смолі і елююють або елюцією SDS (ліва смуга), або розщепленням TEV (правий шлях). Для продовження аналізу мас-спектрометрії рекомендується елюювання SDS, тоді як розщеплення TEV є оптимальним для функціонального аналізу. Для характеристики експресії, клітинної локалізації, подій торгівлі людьми або обороту білка, живих клітин, злиті білки флуоресцентно маркуються та додатково аналізуються на гелях SDS-PAGE або за допомогою конфокальної візуалізації. Доступні як клітинні, так і непрозорі флуоресцентні ліганди, залежно від розташування або представлення злитого білка в клітині.

ild 2 "fo: content-width =" 6in "src ="/files/ftp_upload/51553/51553fig2highres.jpg "width =" 600 "/>Рисунок 2. Експресія білка Halo-BRD4, випадаючий аналіз та аналіз мас-спектрометрії. (A) Гель SDS-PAGE, що демонструє експресію злитого білка Halo-BRD4, 189 кД і злитого білка Halo-tag, 34 кД, контроль (Ctrl) у лізаті клітини HEK293T з лігандом TMR (розділ протоколу 2.1). Гелі сканували за допомогою флюоримаджера для виявлення і використовували флуоресцентний маркер молекулярної маси. (B) Гелі для фарбування сріблом, елюйовані з біологічних копій для витягування зразків Halo-BRD4 та Ctrl з SDS. Розміри молекулярної ваги для гелевих спектральних чисел (ліворуч) та нормалізованих значень спектрального фактора достатку (NSAF) (праворуч), що враховують молекулярні маси білків, виявлені в мас-спектрометричному аналізі біологічних реплікатів Halo. (C) BRD4 та Ctrl. Показано білки, про які відомо, що вони взаємодіють з BRD4, включаючи компоненти pTEFb (CDK9 і циклін T) 18.20 та BRD9 19. У Ctrl не виявлено пептидів з цих білків.

характеристика
Рисунок 3. Виділення та аналіз активності комплексу Halo-HDAC1. (A) Гелі для фарбування сріблом, що демонструють ізоляцію комплексів Halo-HDAC1 та фону з Ctrl після розщеплення TEV (Розділ 2.5 протоколу). Позначені видатний діапазон HDAC1 (55 кДа) та смуга протеази TEV. Безкоштовний HDAC1 оптимізовано розщепленням TEV у лінкері між злитою послідовністю HaloTag та HDAC1 після включення на смолі (Ілюстрація 1). (B) Графік показує активність зразків ізоляції комплексу HDAC1 в аналізі люмінесцентної гістонової деацетилази, що генерується HDAC Glo 21. Колонка 1 графіку показує високий рівень активності HDAC з випадаючими зразками Halo-HDAC1 (HDAC1). У колонці 2 показано, що цю активність можна спеціально зменшити, додавши інгібітор HDAC, SAHA 22, до випадаючих зразків HDAC1. Як контроль, у колонці 3 показаний інгібітор деацетилази, специфічний для сімейства сіртуїнів, але не інгібує HDAC, EX-527 22, не інгібує активність HDAC1, а в колонці 4 активність не спостерігається лише з буфером.

білкової
4. Конфокальне зображення Halo-BRD4 та Halo-HDAC1. Конфокальне зображення живих клітин клітин HeLa за допомогою Halo-BRD4 (A) або Halo-HDAC1 (B) трансфіковані флюоресцентно міченими лігандами TMR. (A) Експресія гало-BRD4 обмежена до ядра і (B) Вираз гало-HDAC1 переважно ядерний. Ліва сторона панелі флуоресцентного каналу і права - накладення флуоресцентного каналу з каналом для кожного DIC. Зображення отримували за допомогою конфокального мікроскопа, оснащеного кліматичною камерою 37 ° C + CO 2 з відповідними наборами фільтрів. Шкала шкали = 20 мкм.

Обговорення

Після того, як злиті білки готові до експериментів на випадіння, для досягнення максимального успіху з використанням протоколу дуже важливо дотримуватись рекомендованих часових рамок в секціях лізису, зв’язування та промивання, оскільки однією з найбільших переваг є швидкість складної ізоляції Процес. Якщо будь-який з цих етапів продовжити у часі, як це потрібно для процедури виявлення на основі антитіл, існує ризик складної дисоціації або посилення неспецифічного зв’язування 8. Так само, якщо час під час клітинного лізису або зв’язування скорочується клітини не повністю лізуються або ефективно захоплюються або захоплюються. Якщо кількість промивань зменшується або при зв’язуванні або промиванні не відбувається хорошого змішування смоли, тоді фонові рівні неспецифічних білків збільшуються. Крім того, засіб лізису дуже важливе, оскільки воно стосується спорідненості до смоли. Спроби ультразвукової обробки зразків, видалення рекомендованого миючого засобу, додавання SDS або іншого сильного миючого засобу та/або яких інгібітор протеази AEBSF зменшить або призведе до втрати зв'язування злитих білків та їх комплексів із смолою.

Як згадувалось у вступі, значний прогрес у протеоміці був активований значним прогресом у мас-спектрометрії 1,7. Тому важливо виділити важливі параметри вибору аналізу мас-спектрометрії для деконволюції суміші білків, отриманих у випадаючих списках. Прилади для вимірювання повинні бути надійними та здатними регулярно та ефективно аналізувати зразки, що містять невелику кількість білка, часто менше 23,24. За допомогою технології HaloTag можна використовувати багатофункціональний підхід, що сприяє дослідженням ProteomICs та отримує краще розуміння функції білків у клітинах ссавців.

Розкриття інформації

Витрати на публікацію цієї статті фінансуються корпорацією Promega. Данетт Л. Даніельс, Жакі Мендес, Хелен Бенінк, Ендрю Найлз, Ненсі Мерфі та Марджета Урх - співробітники корпорації Promega, власників торгівлі шляхом присвоєння патентів на технологію HaloTag та її застосування. Майкл Форд, Річард Джонс, Раві Амунугама та Девід Аллен - співробітники MSBioworks, служби масової спектрометрії, описаної в цьому рукописі.

Подяка

Ми дякуємо Dr. Мартін Розенберг, доктор Гері Тарплі та доктор Кіт Вуд за підтримку цієї роботи та Dr. Джеймс Калі за критичне читання рукопису. DLD, JM, HB, NM, AN, JC та MU є працівниками корпорації Promega. MF, RJ, RA та DA є співробітниками компанії MS Bioworks, LLC.