Високоефективна екстракція ДНК та генотипування личинок 3dpf даніо за протоколом відсікання плавників

Резюме

Рибки даніо використовувались як надійні генетичні моделі організмів у біомедичних дослідженнях, особливо з появою методів генетичної модифікації. При підозрі на фенотипи личинок ідентифікація екстракційної ДНК та генотипу може бути ускладненою. Тут ми описуємо ефективну процедуру генотипування личинок даніо шляхом відсікання хвоста вже через 72 год після запліднення.

Анотація

Вступ

Данио реріо - це організм хребетних, який широко використовується як модель для дослідження хвороби, а також для доклінічного тестування терапевтичних гіпотез 1, 2, 3. Ці тварини мають короткий час генерації, прості в обробці, мають високий рівень розмноження, низьку вартість і легко піддаються генетичним маніпуляціям шляхом мікроін’єкції ДНК у 4 ембріони. Завдяки дедалі більшому розвитку нових трансгенних технологій та технологій редагування генів, таких як нуклеази цинкових пальців (ZFN) 5, TAL-подібні ефекторні нуклеази (TAPS) 6, 7 та регулярно вкраплені короткі кластери паліндромних повторів (CRISPR)/пов'язані з CRISPR 9 (Case9 ) система 8, даніо готовий до значного поліпшення розуміння ряду патологічних станів. Ці технології використовувались для створення цілеспрямованих отворів як у соматичних, так і в статевих клітинах у даніо, ефективно охоплюючи генетично модифікованих тварин 8. Останні приклади в літературі, включаючи розробку генетичних моделей епілепсії та метаболічних порушень у даніо 3, 9, 10, 11, 12 .

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Процедури з тваринами затверджені та відповідають керівним принципам догляду за тваринами, встановленим Канадською радою з догляду за тваринами та Комітетами з догляду за тваринами Університету Оттави.

  1. Підготовка поверхні розтину скотчем 9 см кришкою чашки Петрі з автоклавною стрічкою на внутрішній поверхні. Помістіть його під стереомікроскоп.
  2. Місце запліднення через 3-5 днів (dpf) личинок даніо в чашці Петрі та знеболити в m1,5 мМ трикаїну в зародковому середовищі x E3 1 (5 мМ NaCl, KCl, 0,33 мМ CaCl2, 0, 33 мМ MgSO4, 0,17 мМ, рН 7,2).
  3. Відріжте кінець кінчика піпетки P1000 ножицями або лезом бритви до діаметра 2 мм, щоб вмістити личинку dpf 3 з мінімальним напруженням.

2. остаточне зрізання личинок даніо

3. Екстракція геномної ДНК

  1. Запечатуйте 96-лункову ПЛР-пластину та центрифугуйте зразки при 1000 х g протягом 1 хв, щоб переконатися, що всі фільтрувальні папери занурені в розчин NaOH.
  2. Для лізису тканин нагрівайте зразки в термоциклері при 95 ° C протягом 5 хв з наступним охолодженням при 4 ° C протягом 10 хв.
  3. Додайте 6 мкл 500 мМ трис-HCl, рН 8,0 до кожного зразка. Вихровий.
  4. Коротко центрифугуйте пластину при 1500 xg, протягом 5 хв при кімнатній температурі.
  5. Використовуйте 1,5 мкл супернатанту ДНК на реакцію ПЛР.
  6. Підготуйте ПЛР для генотипу личинок, як зазначено в таблиця 1-2.
    Примітка: Цей протокол був протестований у двох додатках: мультиплексні реакції ПЛР, що виявляють генотип із застосуванням гелів агарози 9 та гетеродуплексний аналіз лиття (HMA), що виявляють генотипи із застосуванням поліакриламідного гелю (PAGE). Електрофорез 17 .

4. альтернативна геномна екстракція з використанням хелатної смоли

  1. Завершіть крок 2.5, додавши фільтрувальний папір з вирізаним плавцем до 96-лункової ПЛР-платівки, що містить 30 мкл 5% хелатної смоли (сополімер стирол-дивінілбензолу, що містить парні іонідіацетатні іони).
    Примітка: Цей тип смоли зазвичай використовується для лізису тканин та приготування готової до ПЛР ДНК швидко та ефективно 18 .
  2. Виконайте кроки 2.6-2.8, як показано.
  3. Зніміть 96-лункову ПЛР та коротко центрифугуйте зразки, щоб переконатись, що весь фільтрувальний папір вбудований в хелатовую смолу.
  4. Для лізису тканин нагрійте зразки в термоциклері при 95 ° C протягом 15 хв з наступним охолодженням до 4 ° C протягом 10 хв.
    Примітка: Цей етап дозволяє лізис і подальше зв’язування бісеру полярної смоли з клітинними компонентами, поки ДНК і РНК залишаються в розчині.
  5. Коротко, центрифугуйте зразки для гранул смоли гранул і отримуйте ДНК у суспензії.
  6. Виконайте кроки 3.5 - 3.6, щоб завершити процедуру генотипування.

5. застосування 1: Мультиплексна ПЛР з подальшим аналізом на агарозний гель

6. застосування 2: Гетеродуплексний аналіз чавуну

  1. Приготуйте гелі PAGE 12%, використовуючи дистанційну пластину 1,5 мм і гребінці з 15 пробами. Приготуйте два гелі PAGE, використовуючи 12,21 мл ddH2O, 2,52 мл 10 х трис/борат/ЕДТА (TBE), 10 мл 30% акриламіду, 250 мкл 10% персульфату амонію (APS) і 20 мкл тетраметилетилендіаміну (TEMED). Використовуйте 1 буфер TBE (0,089 M трис-HCl, 0,089 M борної кислоти і 0,002 M тетраоцтової кислоти (EDTA)) в буфері.
  2. Продукти ПЛР нагрівають при 94 ° C протягом 5 хв.
  3. Охолоджувати пробірки на льоду або в термоциклері протягом 10 хв при 4 ° C.
  4. Навантажують 10 мкл/зразок ПЛР та 8 мкл маркера молекулярної маси.
  5. Проведіть PAGE при 150 V 1 x TBE, використовуючи систему вертикального електрофорезу протягом 1 години або поки маркер молекулярної маси майже не досягне нижньої лінії скляної пластини.
  6. УФ-гель, що дозволяє розрізняти різні генотипи зображення.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

30 мкл. Екстракція ДНК за допомогою хелатової смоли призводить до подібного виходу, наприклад, в середньому 0,5, 3,8 нг/мкл ДНК. Ця кількість ДНК, взята у личинок плавника, утворює геномну ДНК, готову до проведення ПЛР, достатньої якості, щоб дозволити ідентифікувати генотипи. Кожен зразок ДНК може бути використаний в реакціях ампліфікації ПЛР ˜30. Продукти ампліфікації, отримані з використанням праймерів Gen1_FW та Gen2_RV, також можуть бути використані для додатків для секвенування 9, які ідентифікували вставку 5-bp в гомозиготних мутантах (aldh7a1 -/-) (Рисунок 3 ). Секвенсинг Сангера проводився зовнішньою службою, щоб перевірити, чи є продукти ПЛР непридатними для цієї програми. Використовували зразки ДНК агарозного гелю, підтверджені гомозиготними мутантами та WT (n = 3). Були отримані високі бали 19 Phred (> 30), що свідчить про високу якість читання, за винятком першої та останньої 40 пар основ.

Близько 90% (88/98) ВТ та гетерозиготних ембріонів успішно переносяться до дорослого віку (> 2 місяці). Оскільки aldh7a1 та plpbp є мутантами з втратою функції, які проявляють фенотип ранньої смерті, необроблених тварин не можна виховувати у дорослому віці. Однак генотипи всіх вижилих ВТ та дорослих гетерозигот були ідентичними результатам тонкої нарізки личинки, що вказувало на 100% -ву точність ідентифікації генотипу за допомогою процедури біопсії личинкового плавника.

3dpf
Рисунок 1. Затиск кінця личинок. (AT). личинковий плавник Не зламаний при заплідненні через три дні (dpf). Лінія являє собою ділянку трансекції, розташовану в пігментній щілині. Чорний наконечник стріли показує межу каудального кровотоку. (). який слід після закінчення личинки процедури нарізки 3 dpf. (VS). відростання плавників даніо в dpf 5. Регенерація пізньої бластеми спостерігається пізньою трансекцією лише через 2 дні. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Рисунок 2. Процедура зрізання тонких личинок. (AT). личинок розміщують на стрічці і видаляють надлишок зародкових середовищ. Під мікроскопом плавник перетинають до області пігментної щілини, як показано на малюнку 1а. За допомогою мікроскальпеля плавник збирається і кладеться на поверхневий фільтрувальний папір просто дотиком () і може бути легко візуалізований як чорна пляма. Візьміть аркуш фільтрувального паперу, що містить плавник, і виріжте невеликий квадрат, який оточує потрібну область (VS). Помістіть невеликий шматочок фільтрувального паперу, що містить плавник, у лунку 96-лункової пластини (D). Відповідну личинку слід помістити в лунку 96-лункової пласкодонної пластини в 200 мкл ембріонового середовища (Е). Шматок фільтрувального паперу слід занурити в розчин для лізису (F). Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Рисунок 3. Генотипування aldh7a1 гетерозиготних схрещувань біоптатів личинкових плавників. (AT). Очікуваний результат, коли ампліфікація WT та aldh7a1 ot100 алелів призводить до 434-bp амплікону. Смуга 293 п.н. є результатом ампліфікації мутантного алелю (aldh7a1 ot100, вставка 5 PB), а смуга 195 п.н. отримується для алелю WT. (). приклад ампліфікації тканин личинкового плавника aldh7a1 ПЛР. Маркер молекулярної ваги розміром 1 КБ з’являється на доріжці 7. Доріжки 1-6 кожен представляють біопсію з одним плавником. Визначити результати ПЛР aldh7a1 -/- (aldh7a1 ot100/ot100) генотипи (смуга 1), aldh7a1 +/- гетерозиготні генотипи (aldh7a1 +/ot100) (смуги 3, 4 і 5) та (WT) aldh7a1 +/+) генотипи смуги 2 і 6). (VS). вирівнювання секвенированного WT і алеля aldh7a1 ot100, що показує положення інсерційної мутації 5-bp. Цей показник адаптований на основі додаткового рисунка 5 від Pena et al. 9 з дозволу Товариства генетиків Америки. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Компоненти Реакція 20 мкл 100 реакцій Кінцева конц.
Без нуклеази H2O 7,45 ΜL 745 Μл
Go-Taq 2 x (Promega, M7122) 10 ΜL 1000 ΜL 1 х
грунтовка Gen1_FW 0,25 ΜL 25 ΜL 0,125 Μм
праймер 5 nt-ins-specific_FW 0,3 ΜL 30 ΜL 0,15 ΜM
Primerрунтовка Gen2_RV 0,25 ΜL 25 ΜL 0,125 Μм
WT-specific_RV грунтовка 0,25 ΜL 25 ΜL 0,125 Μм
ДНК 1,5 ΜL --

Таблиця 1. Умови мультиплексної реакції ПЛР, що застосовуються для aldh7a1 алель у цьому протоколі. Використовуються наступні праймери: Gen1_FW 5 '- ATGATGCAGCGCGTGCTGAC - 3', "Gen2_RV": 5 '- CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3 "," 5 nt-ins-specific_FW ": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAAC_G: TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3 '. Запаси праймерів становили 10 мкМ.

Компоненти 13 мкл реакції 100 реакцій Кінцева конц.
H2O 3,25 ΜL ΜL 325
Go-Taq 2 x (Promega, M7122) 6,25 ΜL 625 ΜL 1 х
Грунтовка FW 1 ΜL 100 ΜL 0,77 Μм
RV грунтовка 1 ΜL 100 ΜL 0,77 Μм
ДНК 1,5 ΜL --

Таблиця 2. Умови реакції ПЛР, що звикли plpbp алель у цьому протоколі. Грунтовка, що використовувалася раніше, була PLPBP-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 'і зворотна, PLPBP-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'. Запаси праймерів становили 10 мкМ.

Етап циклу Темп. Час Цикли
Початкова денатурація 95 ° С 3 хв 1
Денатурація 95 ° С 30 сек 36
Відпал * Х ° С 30 сек
Розширення 72 ° C 20 сек/кб
Остаточне продовження 72 ° C 5 хв 1
4 ° C Підтримуйте

Таблиця 3. Умови ПЛР, що використовуються в цьому протоколі.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Для отримання якісних результатів необхідно належним чином дотримуватися кількох важливих кроків у протоколі. По-перше, транзит личинок має відбуватися в пігментній канаві, дистальніше межі кровотоку, щоб уникнути кровотечі. Це забезпечує виживання личинок під час біопсії плавника. Крім того, перед розміщенням фільтрувального паперу в розчині NaOH необхідно спостерігати чорну крапку на фільтрувальному папері, яка позначає місце розташування ребра. Це забезпечує присутність тонкої тканини (а отже і ДНК) у кожному зразку. Фільтрувальний папір також слід занурити в розчин NaOH для забезпечення лізису клітин та успішного вилучення ДНК. Цей протокол не перевірявся для віку молодше 3 dpf, оскільки використовувались лише вилуплені личинки. Для наймолодших ембріонів генотипу (17.

30 мкл ДНК отримують на зразок, і

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Розкриття інформації

Автори заявляють, що не мають конкуруючих фінансових інтересів.

Подяка

Автори висловлюють подяку Механізму Мереж (RDMM) (фінансується Канадським Інститутом Досліджень Здоров’я (CIHR) та Genome Canada) та Моделям Рідких Хвороб. CK підтримується стипендією t (Університет Оттави). DLJ підтримується стипендією Vanier Canada. IAP підтримується докторською стипендією Канадських інститутів досліджень охорони здоров’я (CIHR). Автори дякують Американському товариству генетиків за надання дозволу на публікацію цього протоколу та використання адаптації додаткового малюнка 5 від Pena та ін.