Вивчення функцій нееритроїдного α-спектрину - PDF скачати безкоштовно
Вивчення функцій нееритроїдного α-спектрину Sylvain Metral Наведемо цю версію: Sylvain Metral. Вивчення функцій нееритроїдного α-спектрину. Біохімія [q-bio.bm]. Університет Пари-Дідро - Париж VII, 2009. Французька. Ідентифікатор HAL: tel-00377569 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00377569 Надіслано 22 квітня 2009 р. HAL - це міждисциплінарний архів відкритого доступу для зберігання та розповсюдження науково-дослідних документів, незалежно від того, опубліковані вони чи ні. Документи можуть надходити від навчальних та дослідницьких установ у Франції чи за кордоном, або від державних або приватних дослідницьких центрів. Мультидисциплінарний відкритий архів HAL призначений для зберігання та розповсюдження наукових документів наукового рівня, опублікованих чи ні, від французьких або зарубіжних навчальних та дослідницьких установ, державних чи приватних лабораторій.
U.F.R. Науки про життя INSERM UMR_S 665 Будівництво Ламарка Інститут національної трансфузії Сангвінік 35, вулиця Елен Бріон 6, вулиця Олександра Кабанеля 75205 ПАРИЖ CEDEX 13 75739 ПАРИЖ СЕДЕКС 15 Докторська дисертація Паризького університету Дідро - Париж 7 Докторська школа Біологія Біологія та молекулярна біологія Структури, функції та інженерія білків Представлено Sylvain METRAL Для отримання звання доктора Паризького університету Дідро Париж 7 Дослідження функцій не-α-спектрину Захищено в понеділок 6 квітня 2009 р. Перед журі в складі проф. Фернандо РОДРИГУ-ЛІМА, Паризький університет Д-р Елізабет ГЕНО, INSERM U 889 Д-р Фаузі БАКЛУТІ, CNRS UMR 5534 Д-р Азіз ЕЛ-АМРАУІ, ІНСЕРМ UMRS 587 Д-р Стефан ГАСМАН, CNRS UPR 3212 Д-р Марі-Крістін ІНПЕР Екзаменатор Екзаменатор Директор дисертації
Нарешті, я хотів би подякувати всій моїй родині, моїм батькам Жозіане та Клоду, моїм маленьким братам Дідьє та Кетрін, які завжди могли підтримувати мене у сумнівні часи. Цими останніми рядками я віддаю шану своїм бабусям і дідусям, Аделі та Шарлю VIEUX JEANTON.
Зміст
Вступ Рисунок 1: Зображення мембранної мережі спектрину, отримане електронною мікроскопією (A). Схематичне зображення цієї мережі (B) (після (Liu, S.C., Derick, L.H. et al. 1987)). Вузли мережі відповідають зв'язкам між спектрином та актином. Білками, присутніми у вузлах мережі, є: аддуцин, тропоміозин, тропомодулін, ці білки контролюють або регулюють взаємодію спектрин-актин. Інші білки, що містяться в цих білкових комплексах, такі як білки 4.1 і p55, з'єднують спектрин з трансмембранним білком глікофорином С. Щільна область в середині тетрамерів спектрину відповідає іншому ділянці взаємодії з білковим комплексом, що складається з смуги 3 та анкірину (рис. 2 та 3 на сторінці 15). Анкірин, зв’язаний із смугою 3 та з глікопротеїном RHAG (трансмембранні білки), взаємодіє з β-субодиницею, утворюючи друге з’єднання з плазматичною мембраною (Ungewickell, E. та Gratzer, W. 1978; Shotton, DM, Burke, BE та ін. 1979; Liu, SC та Palek, J. 1980; Winkelmann, JC and Forget, BG 1993; Delaunay, J. 2007). 14
Вступ Рисунок 2: Діаграма спектринзалежного скелета мембрани в еритроцитах (зображення взято з огляду Сюлі Ан і Нарла Мохандас (2008)). Рисунок 3: Опис вузлів мережі спектрину в еритроцитах. У еритроцитах роль скелета мембрани і, зокрема, спектрину добре відома: вони забезпечують ліпідний бішар третім підмембранним шаром, що надає йому більшої жорсткості; вони відіграють важливу роль у формі, гнучкості та міцності мембрани. Ці дані 15
Вступ Повторювані одиниці з'єднані між собою довгою спіраллю, яка насправді відповідає спіралі С, пов'язаній із спіраллю А наступної повторюваної одиниці. Ця структура дуже стійка і протистоїть протеолізу (DeSilva, T.M., Harper, S.L. et al., 1997). Первинна послідовність цих повторюваних одиниць погано зберігається, за винятком лейцину в положенні 26 у спіралі С та триптофану 45 у спіралі А (малюнок 5 нижче). Рисунок 5: Відображення вирівнювань послідовностей різних повторюваних одиниць спектрину αiσ1. Повторювана одиниця α1 починається з спіралі A до кінця спіралі C, а потім повторюється одиниця α2. Тільки лейцин 26 у спіралі С та триптофан 45 у спіралі А демонструють сильну збереженість. Послідовності, показані над чорними стрілками, представляють вставки 8 амінокислот, які беруть участь у утворенні димеру αβ-спектрину. Вирівнювання, отримане в дисертації Gaël NICOLAS, 199 взято з наступної статті (Sahr, K.E., Laurila, P. et al. 1990). 22
Вступ Рисунок 6: Представлення різних сайтів та доменів спектру αii/βii (зображення взято зі статті M.A De Matteis, Jon.S Morrow (2000)). III.2.2.1.2 Місце тетрамеризації Скелет мембрани в еритроцитах складається з тетрамерів спектрину довжиною 200 нм. Утворення тетрамера відбувається внаслідок взаємодії між NH 2 кінцем α ланцюга і COOH кінцем β ланцюга (рис. 6 вище). Точно, ця взаємодія включає спіраль C, виділену з α-ланцюга до першої повторюваної одиниці α1, і спіралі A і B з останніх 24
Вступ як біогенез бічних мембран в епітеліальних клітинах (Kizhatil, K. and Bennett, V. 2004). В пробірці було продемонстровано, використовуючи рекомбінантні пептиди, що сайт зв'язування анкірину знаходиться на β-ланцюзі і дуже точно на спіралі B спіральної β-одиниці. Ця спіраль має особливість, яка полягає у відсутності залишку триптофану 45, який дуже зберігається в інших спіралях. Анкірин зв'язується з β-ланцюгом з Kd 0,25 мкм (Kennedy, S.P., Warren, S.L. et al., 1991). Рисунок 7: Представлення деяких білків, що взаємодіють з димером спектру αii/βii (знімок взятий із статті M.A De Matteis, Jon.S Morrow (2000) і доповнений результатами, отриманими в лабораторії. 27
Вступ Рисунок 9: Представлення домену ручного ефекту EF спектрину (MOLSCRIPT), без зв’язаного кальцію (A) або з кальцієм (B) (зображення взято зі статті Г. Траве (Trave, G., Lacombe, PJ et al. . 1995) III.2.2.2.4 Домен SH3 Ланцюги α мають в петлі BC одиниці повторення α9 домен SH3 (домен Src-гомології 3) (Wasenius, VM, Saraste, M. et al. 1989) (рисунок 10 на стор. 31). Ланцюг β-h безхребетних також має домен SH3, у інших β-ланцюгів його немає. Домен SH3 ланцюгів αii надзвичайно збережений, зі 100% ідентичністю між людьми, щурами, курями та ксенопом. є 74% ідентичністю домену SH3 ланцюга αi та ланцюга αii у людини, що означає, що його тривимірна структура добре зберігається між двома α-ланцюгами. Кристалографічні дослідження та ЯМР показують домен із двома β-аркушами, які мають три β-нитки, пов'язані між собою антипаралельно (Musacchio, A., Noble, M . та ін. 1992; Садкі, М., Касарес, С. та ін. 1999). Ця структура утворює гідрофобну канавку, облямовану двома петлями RT-Src та N-Src. Борозниця відповідає ділянці взаємодії з лігандами, що має: - послідовності, багаті проліном PXXPXR або RXPXXP (при цьому X відповідає будь-якій амінокислоті). 30
Вступ - структура PPII (поліпролінова спіраль II), яка являє собою α спіраль з лівою обмоткою, що складається з 3 залишків на поворот. Специфічність взаємодій досягається завдяки двом змінним петлям RT-Src та N-Src, оскільки амінокислоти, що складають гідрофобну кишеню, зберігаються. Kd цього зв’язку може варіювати від 5 до 100 мкм залежно від складу петель (cowburn, D., Zheng, J. et al. 1995). Проте білки, що не мають мотивів, багатих проліном, взаємодіють з цим доменом, вони, скоріше, мають мотив тирозину (Gorina, S. and Pavletich, NP 1996; Romero, F., Dargemont, C. et al. 1996) Деякі взаємодіючі білки з цим домен: - Для ланцюга αi: Abi-I (Ziemnicka-Kotula, D., Xu, J. et al. 1998). - Для ланцюга αii: обмінник Na +/H +, NHE2 (Chow, CW 1999), Synapsin-I (Onofri, F., Giovedi, S. et al. 2000), тирозинфосфатаза LMW-PTP (Nicolas, G ., Fournier, CM et al. 2002) тирозинкіназа Src (Nedrelow, JH, Cianci, CD et al. 2003), EVL (Bournier, O., Kroviarski, Y. et al. 2006), N- WASP (Nicolas, G, докторська дисертація. 1999), GAP-43 (Riederer, BM і Routtenberg, A. 1999), VASP (Benz, PM, Blume, C. et al. 2008). Рисунок 10: Представлення домену SH3 (зображення взято з огляду Ван Беннетта та Ентоні Бейнса (2001)). 31
Вступ Рисунок 11: Представлення двох основних ізоформ αii-спектрину, αiiσi-спектрін має вставку 20 залишків, розташованих у спіралі C повторного блоку 9, тоді як ця петля зрощена в ізоформу нижче αiiσ2. Зображення взято з дисертації Гаеля НІКОЛАСА, 1999. Кальпайн. III.2.2.2.7 Петля CCC (Каспаза Кальмодулін) Ця петля, специфічна для ланцюга αii-спектрину, відповідає вставці 36 амінокислот у спіраль С повторюваної одиниці 10 (α10) (Малюнок 12 на сторінці 34). Ця вставка має сайт зв'язування з кальмодуліном, а також два сайти, чутливі до протеази (Leto, TL, Pleasic, S. et al. 1989; Stabach, PR, Cianci, CD et al. 1997; Wang, KK, Posmantur, R. та співавт. 1998): один для набряків m та 33
Введення µ, активоване кальцієм і друге для каспаз 2 і 3, ферменти, що беруть участь в апоптозі (рисунок 13 на сторінці 35). Розщеплення спектрину кальпаїнами та каспазами в цій петлі може відігравати важливу роль у реконструкції плазматичної мембрани. Однак мишача модель, у якої відсутня ця петля CCC на ланцюгу αii, не виявляла фенотипів (Meary, F., Metral, S. et al. 2007). Рисунок 12: Представлення αi-спектрину, вираженого в еритроцитах, що не мають петлі CCC, та αii-спектрину з цією петлею, чутливою до протеаз (кальпаїни та каспази). Зображення взято з тези Гаеля НІКОЛАСА в 1999 році. 34
Вступ III.2.3 Посттрансляційні модифікації спектрину Рисунок 13: Відображення центральної частини αii-спектрину, а саме домену SH3, та повторюваних блоків 9 та 10, в яких розташовані петля αiiσ1 та петля CCC. У петлі CCC червоними крапками представлені два місця розщеплення протеаз кальпаїну і каспази 3. Зображення зроблено з тези Бьорна РОТТЕРА 2004 р. III.2.3.1 Розщеплення спектрину протеазами III.2.3. 1.1 Розщеплення шляхом кальпаїни Спектрин є субстратом для µ і m кальпаїнів, які є всюдисущими протеазами, активність яких залежить від кальцію при відповідних концентраціях мкм і мм кальцію (Hu, RJ and Bennett, V. 1991; Lofvenberg, L. and Backman, L. 1999; Goll, DE, Thompson, VF et al. 2003). Активність кальпаїнів спостерігається у багатьох клітинних процесах, вони беруть участь у шляхах трансдукції, перебудові адгезійних структур, міграції та загибелі клітин (Harwood, S.M., Yaqoob, M.M. et al., 2005). 35
Вступ Спектрин бере участь в організації плазматичної мембрани Рисунок 14: Відображення ролі мембранного скелета у формі мембрани. (Зображення взято зі статті M.A De Matteis, Jon.S Morrow (2000)). Ця концепція організації мембранних білків мембранним скелетом стабілізує цю мембрану (знижує енергію системи) (рисунок 14 вище). Білки можуть спонтанно деформувати ліпідний бішар до стану нижчої енергії та утворювати везикули за відсутності мембранного скелета або утворювати мікродомени завдяки різним скелетам мембран. У цій концепції можна спостерігати, що форма мембрани, отримана шляхом організації мембранних білків (червоний білок на малюнку 14 вище) без присутності хребта, може бути абсолютно протилежною формі тих самих білків, що взаємодіють з мембранним хребтом. 46
Вступ Гольджі. Цей транспорт здійснюватиметься завдяки дії комплексу динеїн/динактин уздовж мікротрубочок цис-гольджі. Везикули, не прикріплені до спектрину, можуть вводити зворотний транспорт і знову потрапляти в ER. Модель SAATS із залученням спектрину в адресацію білків: Малюнок 19: Модель SAATS (система прив’язки білка-адаптера до спектрину анкірину) може зв’язувати та групувати везикули ендоплазматичного ретикулуму (ER) для здійснення транспорту кількох везикул через білки динеїн та динактин вздовж мікротрубочок до цис-гольджі (1,3). Як альтернатива, SAATS також може бути внутрішньою системою BR (2). Везикули в проміжних відсіках, які не захоплені SAATS, можуть повернутися в ER. Що стосується транс-гольджі (TGN) і після (4), зв’язаний з певними білками спектрин може відігравати роль сортування білків, щоб отримати правильний шлях, адресуючи білки до плазматичної мембрани (МП). (Зображення взято зі статті M.A De Matteis, Jon.S Morrow (2000)). 60
Введення структурних білків, білків, які ремоделюють хроматин, білків, які відіграють роль у транскрипції та розвитку РНК (Sridharan, DM, McMahon, LW et al. 2006), білків, що беруть участь у репарації ДНК, таких як білки "анемії Фанконі" ( FA) сім'я з FANCA або FANCC (McMahon, LW, Walsh, CE et al. 1999; McMahon, LW, Sangerman, J. et al. 2001). Природа цих взаємодій, незалежно від того, були вони прямими або непрямими, не визначена, але ці спостереження дозволяють припустити, що спектрин може мати кілька потенційних функцій в ядрі. 62
Цілі Багато функцій можна виділити нееритроїдному спектрину. Кілька ролей було спеціально віднесено до β-мономерів нееритроїдного спектрину. Щодо одиничного α-мономеру нееритроїдного спектрину, йому було присвячено мало досліджень. Це дослідження було розроблене для отримання інформації про функції α-мономеру, участь αii-спектрину (не-еритроїдного) у клітинних процесах, таких як проліферація, адгезія, міграція. Для дослідження функцій αii-спектрину ми модифікували рівень експресії αii-спектрину за допомогою методики SiRNA та спостерігали фенотипи, що генеруються на клітинній моделі. 65
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Матеріали та методи Таблиця 2: Каталог антитіл, що використовуються в різних дослідженнях. 69
Матеріали та методи Принцип зниження рівня експресії білка методом SiRNA: Рисунок 20: Діаграма принципу зменшення експресії білка за допомогою SiRNA (зображення взято з Інтернету за адресою www.ohsu.edu/research/core/images /SiARN_MWG-biotech.gif). SiRNAs, трансфіковані в клітини у дволанцюжковому стані (dsrna), розпізнаються в цитоплазмі клітини за допомогою білкового комплексу, званого RISC (РНК-індукуючий комплекс замовчування). Цей комплекс, активований вивільненням комплементарного ланцюга РНК, буде розпізнавати конкретну РНК-месенджер, її цільову транскрипт. Після того, як мішень зв’язана, білок ендонуклеази Ago, що входить до комплексу RISC, розріже транскрипт у місці розпізнавання. Два фрагменти стенограми, розщеплені Аго, будуть швидко деградувати через їх кінці екзонуклеазами. Отже, трансфекція SiRNA в клітини призводить до специфічного знищення цільових РНК-месенджерів, запобігаючи будь-якому новому трансляції білка, кодованого цими месенджер-РНК. 71
Матеріали та методи III.3 Електрофорез та вестерн-блот Підготовка зразків до електрофорезу До чотирьох об'ємів білкового лізату додають об'єм буфера для зразків за Леммлі (5Х), що містить DTT, потім зразки денатурують на водяній бані з окропом. протягом двох хвилин. У лунці відкладається від 10 до 40 мкг білків. Об'єм осадження залежить від концентрації білка. Електрофорез проводять у поліакриламідних гелях у концентрації від 7% до 12%, залежно від розміру цікавих білків. Вертикальна міграція відбувається в буфері Tris-Glycine-SDS при постійній напрузі (120-150 В). Перенесення на нітроцелюлозну мембрану Перенесення білків здійснюють у напівсухих умовах у буфері Tris-Glycine на нітроцелюлозній мембрані 0,45 мкм (PROTAN) при постійній напрузі (25 В) протягом 90-120 хвилин. Для вивчення низькомолекулярних білків (