Вплив обмеження калорій на проникність кишечника, маркери запалення та фекалії

предметів

реферат

вступ

Грунтуючись на спостереженні, що ожиріння пов’язане з хронічним, сильно запальним станом та, можливо, порушенням проникності кишечника 7, дане дослідження мало на меті дослідити, чи може обмеження калорій модулювати кишкову проникність і тим самим зменшувати маркери запалення у людини. Крім того, досліджували різноманітність та склад мікробіоти кишечника, а також їх можливий зв’язок із проникністю та запаленням кишечника.

Результати

Дієта зі зниженою калорійністю формули призвела до втрати ваги

Двадцять жінок (середній вік 46, 8 ± 11, 5) були залучені до дослідження, і жоден учасник не кинув навчання. Фізичні та біохімічні характеристики учасників до втручання, безпосередньо після гіпокалорійної дієти та через 14 днів після втручання наведені в таблиці 1. Учасників попросили дієтично (800 ккал/день) та додатково 200 г овочів. Порівняно з початковим споживанням калорій в 1698, 1 ± 592, 7 ккал/день, це втручання спричинило значний дефіцит енергії (Р 23, 24, показало значне зниження після обмеження калорій (Р 25. Концентрація в плазмі на початку дослідження значно зросла після 4-тижневого гіпокалорійного втручання) від (Стор

( a - d ) Графічні графіки на основі порогових значень циклу (КТ) біопсій жирової тканини від 18 учасників до та після 4-тижневого обмеження калорій. ( e ) Для діаметрів жирових клітин були доступні дані від 8 учасників. *** P 2 і зменшився до 4020 ± 773 мкм 2 (n = 8, P = 0,31).

Втручання спричинило індивідуальні зміни в профілях мікробіоти в калі

Щоб розрізнити зниження калорій та втрату ваги, ми обстежили учасників після повернення до збалансованої дієти, що підтримує вагу, протягом двох тижнів поспіль. Дані свідчать про те, що більшість змін, які спостерігаються при низькокалорійній дієті, зникли, що свідчить про те, що ці зміни в основному пов’язані з гострим і глибоким обмеженням калорій, а не з помірним зниженням маси тіла, яке відчувають учасники не набрав значної ваги протягом двох тижнів спостереження.

Як і очікувалось, концентрація маркеру запалення hsCRP у плазмі крові знизилася після VLCD, що узгоджується з літературою 28. Ми також виміряли циркулюючий LBP як сурогатний маркер транслокації компонентів клітинної стінки від грамнегативних бактерій, термін, відомий як негерметична пов'язана з кишечником ендотоксемія 9. Зниження калорій призвело до досить помірного зниження рівня ЛПБ 29, що узгоджується з результатами вимірювань проникності кишечника та, можливо, пов'язаним із цим зменшенням запальних маркерів. Однак проект дослідження не дозволяє зробити чітких висновків про можливий причинно-наслідковий зв'язок між транслокацією ендотоксину та системним запаленням.

Рівень лептину в плазмі крові значно зменшився, тоді як адипонектин HMW збільшився після втручання. На відміну від них, рівні MCP-1 залишались незмінними. Одне з пояснень може полягати в тому, що середня втрата ваги на 7% занадто мала, щоб мати більший вплив на маркери запалення, пов’язані з ожирінням 30. Крім того, зміни в експресії генів для вибраних маркерів у жировій тканині - за винятком лептину - були, ймовірно, незначними через обмежену втрату ваги. Незважаючи на значне зменшення ваги, істотного зменшення розміру жирових клітин підшкірної жирової клітковини в животі не спостерігалося. Однак існує тенденція до зменшення середнього розміру адипоцитів. Верхуф та ін. показали, що втрата ваги на 10% сприяла значному зменшенню розміру адипоцитів 31 .

Втручання також було пов'язане з підвищеною частотою по одній OTU у роді Ruminococcus та Bifidobacterium, що включало як продукти розпаду продуктів харчування складних полісахаридів, так і полісахариди, що походять від господаря 40. Сантакруз та ін. також показав збільшення кількості qPCR Bifidobacterium spp. після втрати ваги (-6,9 кг) у підлітків із ожирінням після 10 тижнів зниження калорій 41 .

Сила нашого дослідження полягає у суворій стандартизації та всебічному фенотипуванні учасників. Крім того, для характеристики впливу VLCD на проникність кишечника використовували широкий спектр різних методів: метаболічний статус оцінювали за допомогою oGTT; Статус запалення досліджували за допомогою різних параметрів циркуляції крові та експресії генів у зразках жирової тканини. Результати додатково підтверджувались даними, що стосуються мікробіоти кишечника, які слідували індивідуальній схемі. Потрібні додаткові дослідження, щоб краще зрозуміти ці різнорідні відповіді.

На закінчення, наші дані свідчать про те, що 4-тижнева дієта VLCD має сприятливий вплив на функцію кишкового бар’єру у жінок із ожирінням, яка швидко зникає після повернення до звичного режиму харчування. Можливий причинно-наслідковий зв’язок між змінами кишкової проникності та змінами, що спостерігаються в метаболічних та запальних біомаркерах, а також у деяких цільових бактеріях, потребує подальшого дослідження.

Учасники та методи

Протокол дослідження був перевірений та затверджений комітетом з етики медичного факультету Технічного університету Мюнхена (затвердження № 5499/12). Дослідження базувалося на керівних принципах Міжнародної конференції з питань гармонізації належної клінічної практики та Гельсінської декларації (у переглянутій версії від Сеула, Південна Корея, 2008). Письмова інформована згода була отримана від усіх учасників до включення в дослідження. Дослідження було внесено до німецького тестового реєстру (DRKS00006210). Датою реєстрації німецького тестового реєстру було 11 червня 2014 року.

Учасники дослідження

Двадцять учасників з ІМТ ≥ 30 кг/м2 були набрані в жовтні 2013 року за допомогою оголошень у районі Мюнхена. Право на участь оцінювали за допомогою детальної скринінгової анкети з деталями історії хвороби. Критеріями виключення були: ІМТ

Вивчати дизайн. Схема дає огляд графіка та різних проведених обстежень. Скорочення: BS, проба крові; FB, біопсія жиру; ФС, зразок калу; ГП, проникність кишечника; IC, непряма калориметрія; МРТ, магнітно-резонансна томографія; NC, Харчові поради; Фізкультура, фізичний огляд; oGTT, пероральний тест на толерантність до глюкози; анкета.

Дієтичні протоколи

Учасникам дослідження було наказано фіксувати споживання їжі протягом усього періоду дослідження. Вміст енергії та склад макроелементів дієт розраховували за допомогою програмного забезпечення OptiDiet Plus (версія 5.1.2.046, GOE mbH, Linden, Німеччина).

Антропометричні вимірювання

Антропометричні та клінічні вимірювання стандартизували між 8 та 9 годиною ранку після нічного голодування. Вага тіла та склад вимірювали за допомогою аналізатора складу тіла TANITA типу BC-418 MA III (Амстердам, Нідерланди). Швидкість метаболізму в спокої (RMR) вимірювали за допомогою навісу (COSMED Quark RMR, Фрідольфінг, Німеччина).

Зразки крові та біохімічний аналіз

Проби крові брали натщесерце. Параметри ліпідів (загальний холестерин, LDL-c, HDL-c, тригліцериди), ферменти печінки (аспартат-трансаміназа (AST), аланін-трансаміназа (ALT), γ-глутамілтрансфераза (γ-GT)), креатинін, сечова кислота та глюкоза натще визначалися SynLab (Мюнхен, Німеччина) проаналізовано. Додатковий зразок крові відбирали, негайно центрифугували (2500 г протягом 10 хвилин при 20 ° C), а потім зберігали при -80 ° C до аналізу. У плазмі були лептин, чемерин, hsCRP, RANTES, MCP-1, HMW-Adiponektin та LBP (усі: НДДКР, Вісбаден, Німеччина), інсулін (Dako, Glostrup, Данія) та зонулін (Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany). досліджували за допомогою комерційно доступних імуноферментних аналізів (ІФА). Кальпротектин у фекаліях вимірювали за допомогою ІФА (CALPROLAB ™ Calprotectin ELISA (HRP), FROST Diagnostika GmbH, Оттерштадт, Німеччина). Всі ІФА проводили, як описано виробниками. NEFA вимірювали за допомогою комерційного набору для тестування (Wako Chemicals GmbH, Neuss, Німеччина). Інсулінорезистентність оцінювали за допомогою HOMA-IR [HOMA-IR = інсулін (мкУ/мл) × глюкоза (ммоль/л)/22, 5] 42.

Пероральний тест на толерантність до глюкози

Пероральні тести на толерантність до глюкози (OGTT) розпочали між 8 та 9 ранку після нічного голодування 12 годин. Після взяття основного зразка крові суб'єкти отримували 75 г глюкози в обсязі 300 мл (AccuCheck®-OGT, Рош, Мангейм, Німеччина). Через 30, 60 та 120 хвилин взяли кров і визначили рівень глюкози (HemoCue Glucose 201 +, калібрована плазмою, Енгельхольм, Швеція).

Кишкова проникність

Обструктивну функцію кишечника оцінювали за допомогою різних неінвазивних тестів. Спочатку кишкову проникність вимірювали за допомогою перевіреного тесту на всмоктування цукру та тесту з ПЕГ. Обидва випробування проводились паралельно. Принцип полягає у вимірюванні виведення з сечею перорально введених речовин з різною молекулярною масою. Тести проводили безпосередньо перед процедурою, після процедури та через два тижні після процедури. Дані представлені як відсоток вживання цукру та відсоток ПЕГ, виявлених у сечі. Ці значення позначаються як% відновлення сечі. Нарешті, маркер кишкової проникності зонулін вимірювали в крові за допомогою ІФА.

Тест на поглинання цукру

Тест на поглинання цукру проводили, як описано Norman et al. 43. Кількість цукрів визначали за допомогою високоефективної рідинної хроматографії з імпульсною електрохімічною детекцією (хроматографічний модуль: 250, Dionex, Ідштейн, Німеччина) 43.

Тест на поглинання поліетиленгліколю

Учасники отримали 100 мл розчину для тестування ПЕГ з молекулярною масою 1 мг (Mr) 400 (PEG 6 -PEG 13; діапазон маси: 285-678 Da), 200 mg Mr 1500 (PEG 20 -PEG 45; маса): 899-2000 Da), 4 г Mr 3000 (PEG 51 -PEG 90; діапазон маси: 2 264-3 982 Da) і 4 g Mr 4000 (PEG 75 -PEG 115: діапазон маси: 3 322-5 084 Da) (Merck Darmstadt, Німеччина). Через п'ять годин після прийому розчину для тестування на цукор розчин для тестування ПЕГ був випитий, а проби сечі відбирали протягом наступних 24 годин. ПЕГ аналізували за допомогою рідинної хроматографії-мас-спектрометрії, як описано Ліхтенеггером та Ричліком 44 .

Біопсія черевної підшкірної жирової тканини

Зразки підшкірної жирової тканини черевної порожнини отримували шляхом голкової аспірації до і після дієти, що відпускається за рецептом. Після промивання в буфері Кребса-Рінгера жирова тканина була розділена на пробірки, що містять стерилізовані цирконієві скляні кульки (Carl Roth, Karlsruhe, Germany), RLT-буфер (RNeasy Mini Kit, Qiagen, Hilden, Germany) та 1% (об./Об.) ) β-меркаптоетанол (# M3148, Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США), а потім негайно заморожений і зберігати при -80 ° C. Для гістології жиру жирову тканину фіксували в 4% забуференному формаліні (рН 7,4) протягом 24 годин і, нарешті, вносили у парафін і зберігали при кімнатній температурі до аналізу. Розмір адипоцитів визначали за допомогою програмного забезпечення для аналізу зображень з відкритим кодом cellprofiler® (http://www.cellprofiler.org/).

Кількісна ланцюгова реакція полімерази

Зразки стільця

Зразки калу збирали безпосередньо в стерильні пластикові контейнери (1000 мл; VWR International, Мюнхен, Німеччина). Потім учасників попросили зібрати пластикову ложку з одного місця фекального матеріалу в пробірці для збору табуретки з 8 мл буфера стабілізації ДНК (Stratec Molecular GmbH, Берлін, Німеччина). Потім зразки калу негайно заморожували при -18 ° C до наступного візиту. Учасники транспортували заморожені зразки стільця до лабораторії за допомогою охолоджувальних установок. Нарешті, пробірки для збору негайно зберігали при -80 ° C.

16 Секвенування амплікона гена S-рибосомальної РНК з високою пропускною здатністю

Зразки обробляли, як описано раніше 48. Коротко кажучи, клітини лізували бісером та термічною обробкою, а метагеномну ДНК очищали за допомогою колонок гДНК (Macherey-Nagel, Düren, Німеччина). Концентрації та чистоту перевіряли за допомогою системи NanoDrop® (Thermo Scientific Waltham, штат Массачусетс, США). Область V3/V4 16 генів S-рибосомної РНК (рРНК) ампліфікували з 24 нг ДНК за допомогою праймерів 341 F та 785 R 49 (25 циклів). Після очищення (система AMPure XP, Beckmann Coulter Biomedical GmbH) та об'єднання в еквімолярних кількостях, 16 ампліконів гена S-рРНК знаходились у режимі спареного кінця (PE275) за допомогою системи MiSeq (Illumina, Inc., Сан-Дієго, Каліфорнія, США). США) згідно з інструкціями виробника та кінцевою концентрацією ДНК 10 пМ та 15% (об/об) стандартної бібліотеки PhiX.

Аналіз послідовності

Файли для читання необроблених даних оброблялись на основі підходу UPARSE 50 з використанням IMNGS 51. Послідовності тестували на наявність химер за допомогою UCHIME 52, а OTU кластеризували на порозі 97% подібності послідовностей. Щоб уникнути аналізу неправильних OTU, у принаймні одному зразку зберігали лише ті, що мають відносну частоту> 0,5% загальних послідовностей. SILVA (SILVA Incremental Aligner Version 1.2.11) 53 та класифікатор RDP (речення 15; 80% достовірність) 54 були використані для присвоєння таксономічної класифікації послідовностям, що представляють OTU. Конкретні OTU з різною частотою між групами були додатково ідентифіковані з EzTaxon. Філогенетичні взаємозв'язки досліджували за допомогою узагальненого методу UniFrac 55. Ефективний підрахунок Шеннона використовували для оцінки різноманітності всередині вибірки (альфа-різноманітність), як описано Jost та співавт. 56 .

Статистичний аналіз

Дані аналізували в середовищі програмування R. Антропометричні та метаболічні дані представлені як середнє значення ± стандартне відхилення. Значення Р використовували 57. Вплив VLCD на OTU та таксономічні переписи було перевірено за допомогою тесту Фрідмана Ранка для аналізу непараметричної рандомізованої конструкції блоку. Відсутні значення були оброблені за допомогою тесту Skillings Mack. Для парних порівнянь був використаний тест підсумованої суми підписаного рангу Вілкоксона для відповідності пар. Метод Бенджаміні-Хохберга використовувався для коригування після декількох тестів. Для аналізу бета-різноманітності розраховувались узагальнені відстані UniFrac за допомогою пакету GUniFrac 55.

день подяки

Ми дякуємо Dr. Клаудія Айххорн за виконання аспірації голкою, Джуліус Хонекер за чудову підтримку у вимірі розміру жирових клітин, Dr. Карін Норман за підтримку у вимірюванні кишкової проникності, Мануела Хуберсбергер за прекрасну технічну підтримку, а Кароліна Зіглер - Анжела Саксенхаузер із ZIEL Core Facility Microbiome/NGS за чудову підтримку у підготовці зразків для високопродуктивної послідовності. Це дослідження фінансувалось BMBF (Федеральне міністерство освіти і досліджень, грант № 0315674). Дієта за рецептами була люб’язно надана Nutrition Santé SAS (Revel, Франція).

Додатковий електронний матеріал

Додатковий файл

Зауваження

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь з нашими умовами використання та правилами спільноти. Якщо ви виявите щось образливе або не відповідає нашим умовам чи інструкціям, позначте це як неприйнятне.