Вплив пренатального стресу на мієлінізацію та формування нейронної мережі
Вплив пренатального стресу на мієлінізацію та формування нейронної мережі в мозку овець плода Дисертація на здобуття вченого ступеня доктор медичних наук (доктор медичних наук), представлена Раді медичного факультету університету Фрідріха Шиллера в Єні Джулією Кендт, яка народилася 5 вересня 1987 в Готі
Рецензент: 1. Проф. Д-р. мед. Маттіас Шваб/Єна 2. Проф. мед. Річард Бергер/Нойвід 3. П. Д. Доктор мед. День громадської оборони Бернда Ромейке/Єни: 6 травня 2014 р
Зміст Зміст Перелік скорочень I 1 РЕЗЮМЕ 1 2 ВСТУП 3 2.1 Клінічне значення пренатального стресу для плода 3 2.2 Розвиток мозку плода 5 2.2.1 Розвиток мозку ембріона 5 2.2.2 Проліферація та міграція клітин 5 2.2.3 Нейрональна та гліальна диференціація 6 2.2.4 Церебральна мієлінізація 7 2.2.4.1 Будова та біохімічний склад мієлінової оболонки 7 2.2.4.2 Функція та значення мієлінової оболонки 9 2.2.4.3 Походження та диференціація олігодендроцитів 10 2.2.4.4 Часовий хід мієлінізації 11 2.3 Вплив пренатального стресу на розвиток мозку плода 13 2.3.1 Церебральний вплив стресу матері 13 2.3.2 Церебральний ефект пренатальної терапії глюкокортикоїдами 14 2.3.3 Регулювання осі стресу 16 2.3.4 Вплив стресу матері та пренатальної терапії глюкокортикоїдами на розвиток осі стресу 18 2.4 Механізми впливу пренатального стресу 19 2.4.1 Передача материнської Стрес на плід 19 2.4.2 Рецепторна дія глюкокортикоїдів 20 2.4.3 Пренатальний стрес і гормони росту 21 2.5 Мета роботи 22
Зміст 3 МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ 25 3.1 Експеримент 25 3.1.1 Експериментальний протокол 25 3.1.2 Отримання головного мозку плода та виготовлення зразків 27 3.2 Гістохімічне та імуногістохімічне фарбування 28 3.2.1 Огляд фарбування гематоксилін-еозином 28 3.2.2 Просочення сріблом за Бєльшовським 29 3.2.3 Імуногістохімічне виявлення MBP 31 3.3 Світломікроскопічна та PC-допоміжна оцінка 35 3.4 Статистична оцінка 39 4 РЕЗУЛЬТАТИ 40 4.1 Вага тіла та маса мозку після пренатального стресу 40 4.2 Церебральний вплив пренатального стресу 42 4.2.1 Формування нейрональних процесів у білій речовині 4.2.1.1 Підкіркова біла речовина 42 4.2.1.2 Мозолисте тіло 47 4.2.1.3 Глибока біла речовина corona radiata 49 4.2.1.4 Внутрішня капсула 51 4.2.2 Мієлінізація нейрональних процесів у білій речовині 53 4.2.2.1 Підкіркова біла речовина 53 4.2.2.2 Корпус мозоль 58 4.2.2.3 Глибока біла речовина - Corona radiata 60 4.2.2.4 Capsula interna 62 4.2.3 Форма Формування нейрональних структур в гіпокампі (область СА3) 64
Зміст 5 ОБСУЖДЕННЯ 69 5.1 Обговорення методів 69 5.1.1 Модель на тваринах 69 5.1.2 Модель стресу 70 5.1.3 Гістологія 72 5.1.4 Кількісний аналіз зображень 74 5.2 Обговорення результатів 75 5.2.1 Пренатальний стрес та ріст плоду 75 5.2.2 Вплив пренатального стресу на гіпокампу 78 5.2.3 Церебральний вплив після пренатального стресу на нейронну мережу 79 5.2.4 Церебральний вплив після пренатального стресу на мієлінізацію 82 6 ВИСНОВКИ 84 7 ЛІТЕРАТУРА ТА ДЖЕРЕЛА 86 8 ДОДАТОК 102 8.1 Подяки 102 8.2 Почесна грамота 103
Список скорочень Список скорочень ABC ACTH ADHD AK AP + T AP + T + S Aqua dest. AVP BM CNP (p) crh GR GT HE HHN вісь 11ß-HSD2 IGF MAG MBP MOG MR MW OMgp PBS PLP REM RT SEM SSW Авідин-Біотин-Комплекс Адренокортикотропний гормон Розлад уваги/гіперактивність Робочий буфер антитіл Робочий буфер + Тритон-X-100 робочий буфер + Тритон + Сироватка Aqua distillata (дистильована вода) аргінін-вазопресин бетаметазон 2-3 -Ціклічний нуклеотид 3-фосфогідролаза (плацентарний) кортикотропін-вивільняючий гормон глюкокортикоїдні рецептори дні вагітності гематоксилін-еозин гіпоталамус-гіпофізар-гіпофізар Гідроксистероїддегідрогеназа типу 2 Інсуліноподібний фактор росту Мієлін-асоційований глікопротеїн Білок основи мієліну Мієлін/олігодендроцит Глікопротеїн Мінералокортикоїдний рецептор Середнє значення Олігодендроцит мієліновий білок Фосфатний буфер Швидкий рух очей Кімнатна температура Стандартна похибка середнього значення
2 Індукція первентрикулярної лейкомаляції (пошкодження білої речовини під час передчасних пологів) під час 0,65 гестації (що відповідає 24-28 тижня гестації у плода людини), високий ступінь порівнянності розвитку мозку між плодовими вівцями та людьми. Це підтверджувалося тим фактом, що в цей часовий проміжок починається дозрівання олігодендроцитів у плодовому мозку овець, і в той же час високий ризик пошкодження незрілої, перивентрикулярної білої речовини може спостерігатися у недоношених дітей (Back et al. 2006, 2001) . На момент народження мозок створеної людини демонструє дещо вищий ступінь зрілості, ніж людський (McIntosh et al. 1979, Astrom 1967). Це може припустити, що творчий розум дозріває швидше в останньому триместрі. 12-й
2 Вступ - скоординована фізіологічна реакція на різні концентрації кортизолу (глава 2.4.2). Рис.2.3: Вісь гіпоталамус-гіпофіз-наднирники та шляхи негативного зворотного зв'язку. Гормон кортикотропіну, що вивільняє (CRH), вазопресин аргініну (AVP), проопіомеланокортин (POMC), адренокортикотропний гормон (ACTH), паравентрикулярне ядро (NPV). Змінено з Metthews 2002. 17
2 Вступ показує часовий хід розвитку мозку, подібний до людського, навіть якщо він дозріває трохи швидше. Загалом оцінювали мозок 45 робітників, які зазнали хронічного стресу між 0,20–0,66 гестацією (30–100-й БТ) через 180-хвилинну ізоляцію два дні на тиждень. Оскільки вівці є стадними тваринами, ізоляція є головним фактором стресу для цього виду. Для того, щоб показати можливі тривалі наслідки, мозок оцінювали на час 0,73 (110-та GT, тривалість гестації 150 днів) та 0,86 гестації (130-та GT). Результати мають на меті допомогти прояснити вплив пренатального стресу на роботу мозку в подальшому житті. 24
3 Матеріали та методи Ізольовано в межах чутності інших тварин, щоб наприкінці протоколу кожна тварина була піддана індивідуальній ізоляції 20 разів. Оскільки вівці є стадними тваринами, вони особливо чутливі до цього стресору. Вимірювання рівня кортизолу до і під час ізоляції підтвердило цей ефект (Rakers et al. 2012). Стресова група Контрольна група Синхронізація циклу еструсу та планове спаровування ПОРІВНЯННЯ Належне розведення собак у пастуха Транспортування вагітних тварин до випробувальної лабораторії Стрес через ізоляцію 2 рази на тиждень протягом 3 год. Хронічна апаратура Отримання головного мозку плода - Група 1 Отримання плодового мозку - Група 2 Природний термін .3.1: Експериментальний протокол У період між 100-м та 110-м ОТ плоди проводили інструментарій за допомогою катетерів, які використовувались для перевірки внутрішньоутробних стресових реакцій (вивільнення АКТГ та кортизолу). Їх оцінка не є предметом цієї роботи (див. Rakers 2012). Після завершення експериментів та оперативного розвитку плодів визначали вагу їх тіла та мозку. Ці вимірювання були проведені 26
3 Матеріал та методи висхідної спиртової серії, зневодненої та закритої кріпильним середовищем Neo-Mount (MERCK GmbH, Дармштадт, Німеччина). Детальний протокол фарбування можна знайти в таблиці 3.2. Середня депарафінізація: 2x Neoclear 2x ізопропанол 100% 1x ізопропанол 80% 1x ізопропанол 50% дистильована вода. Просочення сріблом: AgNO 3 20% 2x вод. Аміачний розчин нітрату срібла дистильована вода + nh 3 (4: 1) Na тіосульфат 5% води з-під крана дистильована вода. Дегідратація: Ізопропанол 50% Ізопропанол 80% 2x Ізопропанол 100% 2x Включення неоклеарного бальзаму з часом Entellan [хв]/Темп. [C] 10/RT 5/RT 5/RT 5/RT 3/RT 90/37 30/45 1- 3/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT Таблиця 3.2: Протокол просочення сріблом за Бєльшовським. RT кімнатна температура. Розчини готують наступним чином: 20% розчин нітрату срібла (AgNO 3): 100 мл дистильованої води. + 20 г нітрату срібла 5% тіосульфату натрію (Na 2 S 2 O 3): 100 мл дистильованої води. + 5 г тіосульфату натрію Препарат для розчину проявника: 25 мл дистильованої води. + 125 мг лимонної кислоти (Fluka Chemie, Buchs, Німеччина) + 5 мл 36% формаліну (Carl ROTH GmbH, Карлсруе, Німеччина) + 8 мкл концентрованої азотної кислоти-ENT 3 (Fluka Chemie, Buchs, Німеччина). 30-й
3 Матеріал і методи 2xAP + T ABC комплекс: AP + T + розчинA + розчинB AP + T 2x PBS дистильована вода. 3'3-діамінобензидин (DAB) 2x вод. Дегідратація: ізопропанол 50% ізопропанол 80% 2x ізопропанол 100% 2x Neoclear 100% бальзам включення з Entellan 5/RT 60/37 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT по 20 мкл розчину A і B в 1 мл набору AP + T 1Set (H2O2 + DAB) для 5 мл дистильованої води, фільтр з фільтром Millipore Таблиця 3.3: Протокол імуногістіохімічного виявлення MBP. Розчини готують наступним чином: Цитратний буфер: 1 літр дистильованої води. + 2,94 г цитрату натрію (Fluka Chemie, Buchs, Німеччина), рН 6,0. PBS: 1 літр дистильованої води. + 1 г робочого буфера D-PBS: 500 мл PBS + 2,5 г бичачого сироваткового альбуміну (альбумін із бичачої сироватки, мінімум 98%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Штернхайм, Німеччина) + 250 мкл TWEEN 20 (моноолаурат поліоксиетилен сорбітану) (Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Штернхайм, Німеччина) ph 7.5. Розчин DAB (субстрат Sigma Fast DAB): 2 таблетки (перекис водню сечовини та 3,3-діамінобензидин) у 5 мл дистильованої води. кружляти до повного розчинення готових таблеток. 34
3 Матеріал і методи Рисунок 3.3: Оглядове фарбування ВН модифіковано, згідно з Атласом мозку овець, Банк біорізноманіття мозку штату Мічиган, Національний науковий фонд https://www.msu.edu/
мізки/мізки/вівці/index.html, 15.02.2012. Зліва: підкіркова біла речовина у фронтальній корі: біля кори [1] та далеко від кори [2]; Мозолисте тіло [3]; Corona radiata [4]; Внутрішня капсула [5]; SV: бічний шлуночок. Праворуч: область CA3 в гіпокампі: черевний відділ [1], спинний відділ [2] 36
3 Матеріал та методи Після цифрового зберігання записи оцінювали в програмі обробки зображень (Scion Image 1.62 NIH, США). Спочатку кольорові зображення були перетворені в чорно-білі зображення з 256 рівнями сірого. Площа позитивного маркування в межах репрезентативного зрізу визначалася за допомогою аналізу зображень. Площа просочення імуноміткою/сріблом відображає імуногістохімічний розподіл антигену/щільність клітинних процесів. Порівняно з мікроскопічним зображенням, верхнє та нижнє порогові значення встановлювали під візуальним контролем. Ці порогові значення утворюють діапазон для селективного представлення позитивної імунореактивності MBP або нервових волокон срібного кольору. (див. рис. 3.4, червоне маркування). Рис. 3.4: Аналіз зображення за допомогою значень сірого A: Мікроскопічне зображення: Нейронні процеси в підкірковій білій речовині лобової кори, віддаленої від кори. 37
3 Матеріал і методи B: Позначення забарвлених розширень клітин на сірому зображенні У порівнянні з мікроскопічним зображенням на сірому зображенні визначена сіра зона (позначена червоним кольором на зображенні), що відповідає позитивному сигналу просочення сріблом. Ця площа вимірюється програмою аналізу зображень. 38