Вплив синергії поживних речовин на клітини остеосаркоми людини U-2 OS; лікар
М. Waheed Roomi, Вадим Іванов, Маттіас Рат та Олександра НедзвецкийАвтор-кореспондент: Олександра Недзвецкий, к.т.н.
1260 Memorex Drive
Санта-Клара, Каліфорнія, 94050 США
Телефон: 408-567-5564
Факс: 408-986-9403
Електронна адреса: [email protected]
Коротка версія
Вступ:
Сучасна терапія первинних злоякісних пухлин кістки або м’яких тканин, що виникають із кісткоутворюючих мезенхімальних клітин, має поганий прогноз, особливо через підвищений ризик розвитку хіміотерапії інших карцином. Тому необхідні нові стратегії лікування, ефективні без токсичних побічних ефектів. Нещодавно проведене в нашій лабораторії дослідження in vitro показало, що Nutrient Synergy (NS), унікальна композиція, що складається з лізину, проліну, аргініну, аскорбінової кислоти та епігалокатехінгалату, має хіміопрофілактичну дію на різні типи раку. NS продемонстрував потенційну синергетичну протипухлинну активність, інгібуючи матричні металопротеїнази, ключові ферменти проти інвазії та метастазування.
Завдання:
Ми вивчили вплив синергії поживних речовин на клітини остеосаркоми людини U-2 Os шляхом вимірювання цитотоксичності, регулювання матриксних металопротеїназ (ММП): ММП-2 та ММП-9 та інвазивного потенціалу.
Методи та речовини:
Клітини остеосаркоми людини U-2 Os культивували в середовищі McCloy, яке обробляли 10% фетальною бичачою сироваткою та на 24-лункових культуральних планшетах з антибіотиком. В місцях злиття клітин встановлювали на рівні 0, 10, 50, 100, 500 та 1000 мкг/мл поживної синергії, кожна доза в трьох примірниках. Цитотоксичність оцінювали за кількістю клітин, виміряних за допомогою МТТ-тесту через 24 години, експресії ММР за допомогою зимографії желатинази в контрольному середовищі та інвазії за допомогою Матрігеля.
Результати:
Синергія поживних речовин була нетоксичною при дозі 10 мг/мл та поточній реакції на токсичність на дозу максимум на 60% вище рівня контролю в 1000 мг/мл. Зимографія показала залежне від дози інгібування виходу ММР-2 та ММП-9 через синергію поживних речовин з практично загальним інгібуванням при концентрації 500 мг/мл. Інвазія клітин остеосаркоми Матрігелем була значно зменшена при 50 мг/мл (74%) і повністю пригнічена при концентрації 100 мг/мл.
Висновок:
Наші результати вказують на те, що синергія поживних речовин є прекрасним кандидатом для терапевтичного використання при лікуванні остеосаркоми через пригнічення експресії ММР, аглогенезу та інвазії - всі важливі та перспективні параметри для скринінгу раку.
вступ
Остеосаркома, первинна злоякісна пухлина кісток або м’яких тканин, що виникає з мезенхімальних клітин, що утворюють кістки, зазвичай розвивається в дистальній частині стегнової кістки (стегнова кістка), проксимальній (до стовбура) великогомілкової кістки (гомілкової кістки), проксимальній плечовій кістці (плечова кістка) та дистальний радіус (спиця). Класична остеосаркома демонструє агресивне швидке зростання з високим ризиком локальних вторинних метастазів та ранніх метастазів у легені. Це найпоширеніший рак кісток і шостий найпоширеніший рак дитячого віку, який зазвичай розвивається у підлітків, які переживають стрибок росту. Це частіше у хлопчиків, ніж у дівчаток. Більшість остеосарком виникають через не успадковані дефекти в ДНК зростаючих кісткових клітин. Оскільки ці помилки трапляються випадково і непередбачувано під час росту кісток, в даний час неможливо ефективно запобігти цьому типу раку (1).
Сучасна терапія остеосаркоми складається з хірургічного втручання (ампутація або операція з порятунку кінцівок) та хіміотерапії. Ці методи лікування пов’язані з поганим прогнозом, особливо через дуже інвазивний характер цього раку та підвищений ризик метастазування та розвитку інших видів раку в результаті хіміотерапії. З 31 пацієнта з діагнозом локалізованої остеосаркоми (2), які лікувались за допомогою звичайної хіміотерапії (високі дози метотрексату та лейковарину у 3 пацієнтів та внутрішньоартеріального цисплатину у 28 пацієнтів) в онкологічному центрі Андерсона, лише у 3 пацієнтів місцевий рецидив або Легеневі метастази протягом наступного періоду 225+ місяців. Побічні ефекти хіміотерапії також включають анемію, аномальні кровотечі, підвищений ризик зараження через руйнування кісткового мозку, печінки та нирок, порушення менструального циклу, цистит та кров у сечі, остеосаркому шкіри та остеосаркому, яка метастазує в легені, мозок та інші кістки (1).
Один з ключових механізмів, за допомогою якого ракові клітини поширюються та метастазують в організмі, також включає ферментативне руйнування сполучної тканини. Терапевтичні спроби обмежити цей процес певними препаратами не мали успіху, і в даний час не існує інших засобів для обмеження метастазів раку. Протягом десятиліть стандартна терапія остеосаркоми складалася з хірургічного втручання та хіміотерапії, які спрямовані на знищення ракових клітин, але не на метастази. Опромінення та хіміотерапія не тільки неефективні для досягнення лікування, але вони атакують усі клітини без розбору, спричиняючи пошкодження клітин, руйнуючи сполучну тканину і тим самим забезпечуючи метастази раку. Очевидно, що існує потреба у безпечній та ефективній природній процедурі, яка може обмежити процес метастазування раку.
Усі типи ракових клітин утворюють пухлини через ослаблення позаклітинного матриксу (ЕКМ) за допомогою різних матриксних металопротеїназ (ММП). Активність цих ферментів поєднується з агресивністю росту пухлини та нав'язливістю раку. У 1992 р. Rath та Pauling (3) визначили, що такі поживні речовини, як лізини та аскорбінова кислота, можуть діяти як природні інгібітори протоаналізу ECM і що вони можуть впливати на ріст та розширення пухлин. Ці поживні речовини можуть здійснювати свій протипухлинний ефект за допомогою різних механізмів. Сюди входять інгібування ММР та зміцнення сполучної тканини, яка оточує ракові клітини (ефект інкапсуляції пухлини). У попередньому дослідженні ми продемонстрували цей антипроліферативний та антиінвазивний потенціал лізину, аскорбінової кислоти, проліну та епігалокатехінгалату (ЕКГК) при раку молочної залози людини (MDA-MB 231), ракових клітинах товстої кишки (товста кишка) (HCT 115) та типах клітин меланоми ( A2058) (4). Синергія поживних речовин також пригнічувала ріст цих пухлин без негативних наслідків для оголених мишей. У поточному дослідженні ми досліджували протипухлинний потенціал синергії поживних речовин in vitro на клітинах остеосаркоми людини типу U-2 OS.
Постановка цілей
Ми вивчили вплив синергії поживних речовин (NS) на клітини остеосаркоми людини U-2 OS шляхом вимірювання цитотоксичності та регуляції матриксних металопротеїназ (MMP), MMP-2 та MMP9, а також інвазивного потенціалу.
Методи та речовини
Клітинні культури
Клітини OS остеосаркоми людини U-2 були отримані з ATCC (American Type Culture Collection, Роквілл, штат Мексика) і вирощені в середовищі МакКоя з 10% фетальною бичачою сироваткою, пеніциліном (100 Од/мл) і стрептоміцином (100 мг/мл ) на 24-лункових культуральних пластинах (Costar, Cambridge, MA). Клітини інкубували з 1 мл середовища при температурі 37 ° С в інкубаторі культури тканин (інкубаторі) з 95% повітрям і 5% CO 2, залишаючись незмінними. В місцях злиття клітини обробляли поживною синергією, розчиняли у середовищі та тестували при 0, 10, 100 та 1000 мМ, кожна доза у трьох примірниках. Потім пластини знову поміщали в інкубатор. Цитотоксичність реагентів перевіряли після наступної 24-годинної інкубації.
Тест МТТ
Життєздатність/цитотоксичність оцінювали після проліферації клітин за допомогою тесту МТТ як у безсироваткових середовищах, так і в середовищах, доповнених 10% PBS. Безсироватковий середовище з клітин видаляли та тестували на MMP. Клітини в лунках промивали змішаним фосфатом фізіологічним розчином (PBS) і до кожної лунки додавали 500 мл МТТ (Sigma # M-2128) 5 мг/мл у PBS. Культурні планшети інкубували при температурі 37 ° С протягом додаткових 2 годин. Носій обережно відсмоктували і до кожного додавали по 1 мл ДМСО (диметилсульфоксиду) для розчинення блакитних кристалів формазану, що утворилися. Оптичну щільність вимірювали при 590 н. OD 550 розчину DMSO у кожній лунці розглядали безпосередньо за допомогою спектрофотометра BioSpec 1501, Shimadzu. OD 590 розчину DMSO у кожній лунці вважався пропорційним кількості клітин. OD 590 контролю (лікування без додавання) вважали 100%.
Желатиназна зимографія
Експресія MMP у середовищі за замовчуванням визначалася за допомогою желатинозної зимографії. Зимографію желатинази візуалізували у 10% поліакриламідному гелі (Bio-Rad, Hercules, CA) у присутності 0,1% гелю. Живильне середовище (20 мл) завантажували і SDS-PAGE демонстрували трис-гліциновим буфером. Після електрофорезу гелі промивали 5% Triton X-100 протягом 30 хвилин. Після промивання гелі інкубували протягом 24 годин при 37 ° С у присутності 50 мМ Tris-HCl, 5 мМ CaCl 2, 5 мМ ZnCl 2, рН 7,5 і протягом 30 хвилин з Coomessie blue R 0,5 % забарвлених і знову забарвлених. Постійно дотримувались білкових норм і визначали приблизну молекулярну масу.
Дослідження вторгнення Матрігеля
Дослідження інвазії проводили, застосовуючи вставки Matrigel (Becton Dickinson) на 24-лункові пластини. Клітини остеосаркоми, суспендовані в розчині середовища, що постачається поживними речовинами, як зазначено в проекті експерименту, поміщали у вкладиш лунок. Як середовище на вставці, так і в чашах отримували однакові добавки. Потім пластини зі вставками інкубували в культуральному інкубаторі, збалансованому з 95% повітрям і 5% CO 2, протягом 24 годин. Після інкубації середовище виймали із лунок. Клітини на верхній поверхні прокладок ретельно вишкрібали ватними паличками. Клітини, які проникли через мембрану Мітрагеля та мігрували на нижню поверхню матригеля, фарбували гематоксиліном та еозином та оптично підраховували під мікроскопом.
Таблиця 1 - Склад синергії поживних речовин
Основний розчин поживної синергії, складений відповідно до пропорцій, показаних нижче, розчиняли у середовищі, як зазначено в проекті експерименту для обробки клітин.
Статистичний аналіз
Результати були наведені як середні значення + SE для груп. Дані аналізували за допомогою незалежного тесту "Т".