Загальногеномне молекулярно-генетичне дослідження варіацій числа копій ДНК (CNV) у
З Інституту невропатології медичного факультету Charité Universitätsmedizin Berlin ДИСЕРТАЦІЯ Молекулярно-генетичне дослідження геномних змін кількості копій ДНК (CNV) у холангіоцелюлярних карциномах для здобуття наукового ступеня Доктор медичних наук (доктор медичних наук). Раменське Дата доктора: 09.09.2016
Рисунок 1-1 Класифікація підтипів холангіокарциноми на внутрішньопечінкові та позапечінкові (перигілярні та дистальні) на основі анатомічного розташування згідно з класифікацією UICC. Модифіковано з Blechacz et al, 2011 (10) 1.3 Епідеміологія холангіокарциноми Частота холангіоцелюлярної карциноми, яка становить 3% всіх пухлин шлунково-кишкового тракту, зростає у всьому світі (12, 13). Однак захворюваність сильно варіюється між країнами: показник 1-2/100 000 у Західній Європі та до ста разів вищий у Південно-Східній Азії (14). За цю невідповідність відповідають різні місцеві фактори ризику та генетичні умови (15). Як при внутрішньо-, так і позапечінковій холангіокарциномі чоловіки страждають частіше, ніж жінки у всьому світі, із співвідношенням 1,5 (14). В обох підтипах більшість постраждалих старше 65 років, коли діагноз ставлять (16). Однак пацієнти перебувають у країнах із більшим рівнем захворюваності (Південно-Східна Азія) 7
Малюнок 1-2 Макроскопічна класифікація внутрішньопечінкових холангіокарцином за даними Японської дослідницької групи з питань раку печінки (LCSGJ). Blechazc et al, 2011 (10) У випадку позапечінкових холангіокарцином знову розрізняють екзофітну та інтрадуктальну схему росту (42), причому обидва типи асоціюються з периневральною інвазією та ураженням лімфовузлів (10). Для гістологічної класифікації холангіокарцином, крім класифікації ВООЗ, існує поточна редакція AJCC/UICC, яка описує аденокарциноми як найпоширенішу форму, а також рідкісні форми (аденосквамозні та плоскоклітинні карциноми, муцинозні, клітиноподібні клітинні клітини, саркоматозні, лімфоепіт, лімфоепіт 43, 44). Найбільш поширеною формою холангіоцелюлярної карциноми є помірно до добре диференційована аденокарцинома, яка характеризується залозистою або канальцевою структурою. Тут кубічні або стовпчасті анапластично модифіковані клітини епітелію демонструють еозинофільну цитоплазму з круглими центральними ядерцями. Гетерогенні пухлинні клітини часто поширюються вздовж стінок жовчних проток та нервових оболонок (45). 11
Щодо фармакологічної терапії холангіокарциноми до 2010 року не було стандартизованої хіміотерапії через недостатньо даних. Монотерапія гемцитабіном, яка часто використовується, дала лише незадовільні результати (98). Однак під час досліджень NCRI ABC-01 та ABC-02 з Англії була встановлена потенційно необхідна тенденція терапії, що складається з гемцитабіну та цисплатину для нерезектабельних пухлин системи жовчних проток (99, 100). Результати цих досліджень також можуть бути підтверджені порівняльним дослідженням в Японії (101). Моноклональні антитіла, які конкретно втручаються в молекулярні процеси, також є новими терапевтичними підходами (102). Їхні поточні вихідні точки та новіші результати досліджень будуть розглянуті далі в розділі обговорення. 19-го
3 Матеріал та методи 3.1 Пацієнти та зразки пухлини Для індивідуальних обстежень були доступні різні групи зразків пухлини, які детально представлені. 1. Для аналізу за допомогою молекулярно-інверсійного зонда (MIP) використовували імуногістохімію та флуоресценцію in-situ гібридизацію (FISH), 24 зразки пухлини, закріплені у формаліні, вбудовані в парафін (FFPE) з архівів Інституту патології, Charité - Universitätsmedizin Berlin. Всі зразки визначали для МІП та імуногістохімічного дослідження та 20 відібраних зразків для аналізу FISH (табл. 3-1). Таблиця 3-1 Популяція пухлини FFPE. 21-го
2. Для дослідження з використанням RT-PCR, 30 криоконсервованих зразків пухлин, які після хірургічного видалення були шоково заморожені в рідкому азоті і зберігалися при -80 С, з архіву Клініки загальної, вісцеральної та трансплантаційної хірургії, Charité - Universitätsmedizin Berlin ( Таблиця 3-2). Цей колектив включає лише внутрішньопечінкові холангіокарциноми. Таблиця 3-2 Популяція кріоконсервованих пухлин. 22-го
Завдяки сучасній мультиплексній технології, понад 20 000 MIP-процесів можуть пройти процес за один підхід і таким чином проаналізувати. Рисунок 3-2 Послідовність реакцій підходу MIP: (1) Приєднання MIP до геномної ДНК (2) Заповнення проміжків шляхом полімеризації (3) Лігування гомологічних кінців MIP (4) Екзонуклеаза видаляє непрореаговали зразки (5) Вивільнення зразка (6 ) Посилення MIP за допомогою ПЛР. Змінено з Харденбола та ін., 2003 (105) 26
Рисунок 3-3 Короткий опис робочого процесу MIP. Модифіковано згідно з Hardenbol et al, 2003 (105) Матеріал та розчини: Для проведення дослідження MIP 75 нг раніше вилученої ДНК геномної пухлини переносили у водний розчин. Виконання: Гібридизація на масиві OncoScan TM FFPE Express 2.0. Метод зонду молекулярної інверсії був проведений Affymetrix (Санта-Клара, США). 3.5 Аналіз даних копіювання номерів за допомогою програмного забезпечення для копіювання номерів Nexus. Кожен зразок масиву MIP визначає локалізацію вздовж геному, яка визначається інтенсивністю флуоресценції MIP буде. Перетворення інтенсивності сигналу в зміни кількості копій називається сегментацією. Алгоритм SNP-FASST2, який використовується програмним забезпеченням Nexus, пов'язує інтенсивність масиву в експерименті із внутрішнім контролем і перетворює це, використовуючи логарифм до бази 2 (log2). У цьому випадку лише непухлинні зразки кластеризуються в якості контролів, які потім служать еталонним сигналом, з яким покроково порівнюється кожна проба пухлини. Відповідно, видалення призводить до заданого розташування SNP 27
при меншій інтенсивності сигналу порівняно з еталонною, тоді як посилення призводить до збільшення сигналу (рис. 3-4). Рисунок 3-4 Схематичне зображення віднесення інтенсивності сигналу MIP до місця вздовж хромосоми. Посібник із номеру копії Nexus (NEXUS COPY NUMBER, Biodiscovery, Hawthorne, USA) Для кожного зразка ці значення log2 відображаються на осі x як розташування зразка та на осі y як значення коефіцієнта логарифму (рис. 3-5). Рисунок 3-5 Приклад результатів експерименту та його подання у вигляді графіка вздовж геному. Посібник із копіювання номеру Nexus (NEXUS COPY NUMBER, Biodiscovery, Хоторн, США) 28
Рисунок 3-6 Схематичне зображення частоти аллелю B. Посібник із номеру копії Nexus (NEXUS COPY NUMBER, Biodiscovery, Hawthorne, USA) Ця інформація про статус номера копії та відношення алелів дозволяє програмному забезпеченню викликати сигнали інтенсивності. Наступна таблиця 3-3 пояснює, як слід інтерпретувати сигнали. У разі виграшу однієї чи кількох копій номер очікується побачити алельний дисбаланс на діаграмі частоти алелів. Посилення рідко може бути настільки сильним, що майже витісняє присутність іншого алеля, так що представляється образ LOH. Втрата копії алеля відображатиметься як LOH, тоді як гомозиготна втрата - як загальна алельна втрата. Поєднання незмінного стану номера копії та LOH на діаграмі частоти алелів вказує на нейтральний LOH копії. Цей процес, також відомий як однородова дисомія (UPD), відбувається, коли обидва алелі передаються одним із батьків. 30-й
Таблиця 3-3 Результати, які слід очікувати при поєднанні стану номера копії та частоти аллелю B. Посібник із копіювання номерів Nexus (NEXUS COPY NUMBER, Biodiscovery, Hawthorne, USA) Впровадження: Вихідні дані аналізували за допомогою програмного забезпечення Nexus 6 Copy Number (Biodiscovery, El Segundo, CA) з NCBI build 36.1 геному людини. Для цього був обраний алгоритм сегментації SNP-FASST2. 3.6 Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) Методика ПЛР in vitro дозволяє цілеспрямовано дублювати послідовності ДНК, які обрамлені відомими сегментами ДНК. Площа ДНК, що підлягає реплікації, обмежена штучно виготовленими праймерами, які служать стартовим допоміжним засобом. Праймери - це короткі одноцепочечні молекули ДНК, які комплементарні кінцям визначеної послідовності матриці ДНК. Після первинної денатурації дволанцюжкової ДНК на дві одиничні ланцюги та подальшого відпалу праймера, ДНК-полімераза поширюється в заздалегідь визначених умовах реакції та в присутності 31
IDH-2 вперед: 5 -AGAATTTTAGGACCCCCGTCTG-3 Реверс IDH-2: 5 -AAAACCCCACTTCTGGTAAA-3 3.7 Електрофорез в агарозному гелі Отриманий продукт ПЛР виявляють шляхом розділення фрагментів ДНК за допомогою гель-електрофорезу. Застосування електричного поля до гелю призводить до міграції сегментів ДНК до анода через негативно заряджені залишки фосфату. Після фарбування смуг ДНК бромідом етидію, флуоресцентним барвником, який інтеркалює з ДНК, окремим смугам ДНК можна присвоїти певний розмір за допомогою стандарту. Матеріал та розчини: 2% агарозний гель (SERVA, Гейдельберг, Німеччина) зі 100 мкл броміду етидію на 100 мл розчину гелю 50 х буфер TAE (AppliChem, Дармштадт, Німеччина). Реалізація: Продукти ПЛР завантажували на 2% агарозний гель і після подачі напруги 100 В розділяли гель-електрофорезом протягом приблизно 20 хвилин. 3.8 Очищення ПЛР для секвенування Щоб уникнути перекриття сигналу під час секвенування, продукт ПЛР перед очищенням від реакції секвенування повинен бути очищений від праймерів, надлишку нуклеотидів, солей та Taq полімерази. 33
Матеріал та розчини: 3,85 мкл аквабідеста 0,1 мкл 1U/мкл SAP 0,05 мкл 1U/мкл 200U/мкл Exo I 0,5 мкл Exo I буфер 0,5 мкл SAP буфер 5 мкл продукту ПЛР Процедура: Для ферментативного очищення реакційну суміш загальним об'ємом 10 мкл нагрівали в термоциклері до 37 ° С протягом 30 хвилин, а потім до 85 ° С протягом 15 хвилин. 3.9 Секвенування ДНК Метод секвенування згідно з Sanger et al. (106, 107), який також відомий як метод припинення ланцюга або дідеоксинуклеотид, можна проаналізувати одноланцюгові кДНК та ГДНК, які присутні в якості єдиного ланцюга в реакції секвенування внаслідок денатурації. Використовуючи мічені флуоресценцією дидеоксинуклеотиди (кожен з чотирьох ddntps пов'язаний з різним маркером флуоресценції), реакція секвенування може проходити в реакційній суміші, оскільки виявлення смуг для кожної з чотирьох ddntps призводить до різного кольорового сигналу. Матеріал та розчини: 2 мкл 10 мм грунтовки TP362/TP363 2 мкл ферментативно очищеного продукту ПЛР 8 мкл аква бідеста 34
Перевірити посилення та втрати на зрізах ДНК. Інтерфази FISH проводили на зрізах ТМА за допомогою набору аксесуарів Histology FISH (Dako, Гамбург, Німеччина) відповідно до інструкцій виробника. Зонди FISH, перелічені в таблиці 3-4, використовувались для виявлення ампліфікацій та делецій. Гібридизація проходила в автоматичних машинах для гібридизації (Dako, Гамбург, Німеччина) та була люб’язно надана Dr. Дідо Ленце, Інститут патології, Шаріте - Університет Берліну. Таблиця 3-4 Короткий зміст використовуваних зондів FISH Виявлення та кількісна оцінка сигналу проводилася на Axio Imager Z1 (Zeiss, Єна, Німеччина) та програмному забезпеченні Isis (версія 5.3.1, MetaSystems, Altlussheim, Німеччина). Для оцінки кількості копій кожної окремої проби були підраховані специфічні для гена та центромери сигнали в 20 ядрах пухлинних клітин, що не перекриваються. Тепер ген-специфічні сигнали порівнювали із специфічними для центромери сигналами (кількість копій генів: кількість копій хромосом). Посилення становило коефіцієнт> 2,2 і фактор 50%. 50
Рисунок 4-6 Короткий зміст мутаційного аналізу IDH-1 та IDH-2 з репрезентативними прикладами мутацій в генах IDH-1 та IDH-2. 54