Захист судин від атеросклерозу - роль мікроРНК, що виділяються

Карін Трегер 1, 2 *, Сюзанна Гейдт 1 та Едуард Хергенрайдер 1

захист

1 Центр молекулярної медицини, Інститут серцево-судинної регенерації, Медична школа Франкфуртського університету, 60590 Франкфурт-на-Майні, Німеччина
2 Поточна адреса: UMR CNRS 5164, Університет Бордо 2, 146, вулиця Лео Санья, 33076 Бордо, Франція

Вплив потоку на встановлення атероматозного нальоту. Верхня рамка: Ламінарний потік індукує експресію KLF2 в ендотеліальних клітинах (ЕК). KLF2 відповідає за підтримку скорочувального та атеропротективного фенотипу основних клітин гладкої мускулатури (СМК). Нижній каркас: коли потік турбулентний, навколо атеросклеротичної біфуркації або бляшки, експресія KLF2 в ЕК зменшується, і основні СМС припускають проатеросклеротичний проліферативний фенотип. Спілкування між радами працівників та ХМЛ за допомогою KLF2 є предметом цього дослідження.

МіРНК: новий рівень регуляції експресії генів

Медіаторами вибору цього зв’язку між СЕ та ХМЛ є мікроРНК (miРНК). МіРНК - це невеликі одноланцюгові некодуючі РНК (22 нуклеотиди), які транскрибуються в ядрі, розщеплюються - зокрема, ферментами Дроші та Дічера - і включаються в комплекс мовчання що призводить до інгібування трансляції або деградації мРНК-мішеней [7, 17]. Ці молекули вже відомі своєю важливою роллю у васкуляризації, а також у різних судинних патологіях [8]. Нашою метою було визначити, чи може KLF2 регулювати експресію міРНК в ЕК та сприяти цим судинно-протекторним ефектам.

Зсувні сили регулюють експресію міРНК в ЕС через KLF2

Спочатку ми визначили miRNAs, регульовані KLF2 та силами зсуву в EC. Цей подвійний аналіз дозволив визначити нові цілі KLF2 у відповідь на потік: скупчення miR-143/145. Ми перевірили ці мікроРНК-кандидати, визнавши недійсним KLF2 в пробірці, і ми показали, що за відсутності KLF2 це скупчення більше не індукується зусиллями зсуву. Крім того, KLF2 здатний зв'язуватися з промотором цього скупчення і викликати його вираз. Тому сили зсуву індукують експресію KLF2 в ЕС, а це, в свою чергу, індукує експресію miR-143/145. Це скупчення раніше був відомий своєю атерозахисною дією на SMC [9].

мікроРНК та міжклітинний зв’язок: між СЕ та ХМЛ

Ми прагнули перевірити, чи може KLF2 паракрично контролювати SMC через miR-143/145. Недавні дослідження продемонстрували наявність позаклітинних міРНК у різних рідинах тіла [10], циркулюючих мікроРНК, які є справжніми біологічними індикаторами при різних патологіях, таких як рак [11, 18] або серцево-судинні захворювання [12]. Біологічна функція циркулюючих мікроРНК ще не до кінця зрозуміла, але, схоже, вони можуть відігравати певну роль у взаємодії клітини з клітиною [13].

Кров містить численні рибонуклеази, і циркулюючі мікроРНК, як вважають, захищені від деградації шляхом зв’язування білків або шляхом їх включення у везикули [15, 16], останній механізм сприяє. (Малюнок 2А).

Аналіз міжклітинної комунікації. AT. Біохімічний аналіз захисту позаклітинних міРНК. Зразок обробляють протеїназою К або миючим засобом для розкладання білків або ліпідних мембран, потім РНК деградують обробкою РНКазою. Якщо вони погіршуються, це вказує на те, що вони були доступними, і виявляє тип захисту, білок або мембрану. B. Система спільної культури для вивчення передачі матеріалу між ЄС та СМЦ. PBS: фосфатний буфер фізіологічний розчин.

Ми проаналізували супернатант CE, що надмірно експресує KLF2 або зазнає напруги зсуву. Використовуючи техніку, описану в Малюнок 2, ми змогли показати, що ці мікроРНК були присутніми у позаклітинному середовищі та захищені у везикулі (Малюнок 2А). Визначено та класифіковано різні типи везикул відповідно до їх розміру та механізму утворення. Поглиблений аналіз (зокрема, за допомогою електронної мікроскопії) дозволив нам визначити, що пухирці, що містять miR-143/145, мали б тип мікровезикул та/або екзосоми (МВ).

Щоб перевірити, чи SMC дійсно здатні використовувати вміст пухирців, що виділяються EC, ми провели кокультури між ендотеліальними клітинами, що експресують eGFP (зелений флуоресцентний білок) або трансфікована міРНК з C. elegans (cel-miR-39) та базові SMC (Малюнок 2B). Імунофлуоресцентний аналіз SMC показав присутність eGFP, а аналіз RT-qPCR виявив присутність мРНК, що кодує eGFP, демонструючи, що EC передавали везикули мРНК SMC. За допомогою аналізу RT-qPCR ми також змогли виявити присутність cel-miR-39 у MV; вони також передаються SMCs, культивованих з CE, трансфікованим cel-miR-39. МВ, що виробляються транспортними мРНК та мікроРНК ЄС, і можуть бути включені SMC.

МіРНК, що містяться в ендотеліальних МВ, мають атерозахисний ефект на SMC

miR-143/145, що експресується обома типами клітин, ми тоді прагнули перевірити, чи внесок цих miРНК з боку ЕК впливав на фенотип SMC. Отже, ми пригнічували ендогенне вироблення міРНК у SMC, інгібуючи Drosha (ХМЛ КО). Коли ці SMC, які не експресують ендогенні мікроРНК, вирощують у присутності CE, що надмірно експресує KLF2, виявляється збільшення miR-143/145. Це вказує на те, що miR-143/145 був транспортований з ЄС до SMC. І ми показали, що ці мікроРНК, захоплені KO SMC, призводять до зменшення проатеросклеротичних цілей, таких як ELK1 (E двадцять шість як фактор транскрипції I), KLF4 та SSH2 (білка фосфатаза рогатки-I); тому ендотеліальні miРНК miR-143/145, передані SMC, відповідають за атерозахисні ефекти, що спостерігаються у SMC (Малюнок 3).

Зв'язок між судинною ЕК та ХМЛ. Ламінарний потік індукує експресію KLF2 в ЕС. KLF2 індукує транскрипцію miR-143/145, яка буде передаватися SMC в мікровезикулах. У SMC miR-143/145 пригнічує вираз ELK1 і KLF4 та інгібує розповсюдження, дозволяючи a перемикач по відношенню до скорочувального, атерозахисного фенотипу.

Ми перевірили у природніх умовах атерозахисний ефект цих МВ, збагачених miR-143/145 (виробляється ЕК, що надмірно експресують KLF2). Для цього MV вводили мишам із схильністю до розвитку атеросклерозу (миші АпоЕ -/- ) при жирному харчуванні, і ми кількісно визначили пошкодження артерій. Оброблені миші виявляють менше уражень, ніж контрольні миші. Крім того, інгібування виробництва мікроРНК скасовує сприятливий ефект MVs, що спостерігається у природніх умовах.

Терапевтичні програми

Ця робота дозволила висвітлити зв'язок між радами робітників та SMC через циркулюючі мікроРНК. У відповідь на кровотік активація KLF2 дозволяє виробляти miR-143/145, які передаються SMC через МВ. Ці мікроРНК в SMCs будуть пригнічувати експресію про-атерогенних факторів (Малюнок 3).

Ці обнадійливі результати можуть призвести до цікавих терапевтичних застосувань. З ВМ можливо зменшити розвиток атероматозних бляшок у людей, що перебувають у групі ризику, особливо у людей з ожирінням. Ця стратегія може бути застосована до інших патологій, де експресія міРНК нерегульована (рак, серцево-судинні захворювання), оскільки МВ є засобом спрямованості на лікування міРНК. Як ми показали при атеросклерозі, введення міРНК через MV можна робити внутрішньовенно. Вироблятимуть МВ в пробірці з власних клітин пацієнта, зменшуючи ризик побічних ефектів. Вибір типу донорської клітини дозволить спеціально адресувати мікроРНК до клітин-мішеней, що підлягають лікуванню. Крім того, клітинами-продуцентами пацієнта можна маніпулювати, щоб змінити вміст МВ, який буде доставлений до цільових клітин.

Посилання, що цікавлять

Автори заявляють, що не мають ніякого інтересу стосовно даних, опублікованих у цій статті.

Зсувні сили, або зсувні напруги, - це сили тертя, що діють кров’ю на стінку судини. Вони залежать від кровотоку, в’язкості крові та діаметра судини. За відсутності будь-якої перешкоди або роздвоєння потік є ламінарним, а сили зсуву максимальними.

Список літератури

  1. Малек А. М., Альпер С. Л., Ізумо С. Гемодинамічний стрес на зсув та його роль в атеросклерозі. JAMA 1999; 282: 2035–2042. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  2. Бун Р.А., Горревець А.Ж. Основні транскрипційні регулятори вазопротекторних ефектів напруги зсуву. Hamostaseology 2009; 29: 39–40. [PubMed] [Google Scholar]
  3. Kuo CT, Veselits ML, Barton KP, et al. Фактор транскрипції LKLF необхідний для нормального формування середовища оболонки оболонки та стабілізації кровоносних судин під час ембріогенезу мишей. Genes Dev 1997; 11: 2996–3006. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  4. Lee JS, Yu Q, Shin JT та ін. Klf2 є важливим регулятором судинних гемодинамічних сил in vivo. Dev Cell 2006; 11: 845–857. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  5. Ву J, Боханан CS, Neumann JC, Lingrel JB. Транскрипційний фактор KLF2 модулює дозрівання кровоносних судин шляхом міграції гладком'язових клітин. J Biol Chem 2008; 283: 3942–3950. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  6. Hergenreider E, Heydt S, Treguer K, et al. Атеропротективний зв’язок між ендотеліальними клітинами та клітинами гладких м’язів за допомогою мікроРНК. Nat Cell Biol 2012; 14: 249–256. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  7. Бартель Д.П. МікроРНК: розпізнавання цілей та регуляторні функції. Клітина 2009; 136: 215-233. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  8. Бонауер А, Бун Р. А., Діммелер С. Судинні мікроРНК. Curr Drug Targets 2010; 11: 943–949. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  9. Rangrez AY, Massy ZA, Metzinger-Le Meuth V, Metzinger L. miR-143 та miR-145: молекулярні ключі для перемикання фенотипу судинних клітин гладких м’язів. Circ Cardiovasc Genet 2011; 4: 197–205. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  10. Weber JA, Baxter DH, Zhang S, et al. Спектр мікроРНК у 12 рідинах організму. Clin Chem 2010; 56: 1733–1741. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  11. Schwarzenbach H, Hoon DS, Pantel K. Безклітинні нуклеїнові кислоти як біомаркери у хворих на рак. Nat Rev Cancer 2011; 11: 426–437. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  12. Fichtlscherer S, Zeiher AM, Dimmeler S. Циркулюючі мікроРНК: біомаркери або медіатори серцево-судинних захворювань? Arterioscler Thromb Vasc Biol 2011; 31: 2383–2390. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  13. Creemers EE, Tijsen AJ, Pinto YM. Циркулюючі мікроРНК: нові біомаркери та позаклітинні комунікатори при серцево-судинних захворюваннях? Circ Res 2012; 110: 483–495. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  14. Weickmann JL, Glitz DG. Рибонуклеази людини. Кількість панкреатичних ферментів у сироватці крові, сечі та органах. J Biol Chem 1982; 257: 8705–8710. [PubMed] [Google Scholar]
  15. Wang K, Zhang S, Weber J, et al. Експорт мікроРНК та мікроРНК-захисного білка клітинами ссавців. Нуклеїнові кислоти Res 2010; 38: 7248–7259. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  16. Arroyo JD, Chevillet JR, Kroh EM та ін. Комплекси Argonaute2 несуть популяцію мікроРНК, що циркулюють, незалежно від везикул у плазмі людини. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108: 5003–5008. [CrossRef] [Google Scholar]
  17. Дюноєр Патріс. Битва за тишу: механізм та пригнічення мовчання РНК під час взаємодії рослин/вірусів. Med Sci (Париж) 25: 5,505–512. [CrossRef] [EDP Sciences] [PubMed] [Google Scholar]
  18. Ladeiro Y, Zucman-Rossi J. Мікро-РНК (miRNA) та рак: випадок гепатоцелюлярних пухлин. Med Sci (Париж) 25: 5467–472. [CrossRef] [EDP Sciences] [PubMed] [Google Scholar]

Список малюнків

Вплив потоку на встановлення атероматозного нальоту. Верхня рамка: Ламінарний потік індукує експресію KLF2 в ендотеліальних клітинах (ЕК). KLF2 відповідає за підтримку скорочувального та атеропротективного фенотипу основних клітин гладкої мускулатури (СМК). Нижній каркас: коли потік турбулентний, навколо атеросклеротичної біфуркації або бляшки, експресія KLF2 в ЕК зменшується, і основні СМС припускають проатеросклеротичний проліферативний фенотип. Спілкування між радами працівників та ХМЛ за допомогою KLF2 є предметом цього дослідження.

Аналіз міжклітинної комунікації. AT. Біохімічний аналіз захисту позаклітинних міРНК. Зразок обробляють протеїназою К або миючим засобом для розкладання білків або ліпідних мембран, потім РНК деградують обробкою РНКазою. Якщо вони погіршуються, це вказує на те, що вони були доступними, і виявляє тип захисту, білок або мембрану. B. Система спільної культури для вивчення передачі матеріалу між ЄС та СМЦ. PBS: фосфатний буфер фізіологічний розчин.

Зв'язок між судинною ЕК та ХМЛ. Ламінарний потік індукує експресію KLF2 в ЕС. KLF2 індукує транскрипцію miR-143/145, яка буде передаватися SMC в мікровезикулах. У SMC miR-143/145 пригнічує вираз ELK1 і KLF4 та інгібує розповсюдження, дозволяючи a перемикач по відношенню до скорочувального, атерозахисного фенотипу.

Поточні показники використання показують сукупний підрахунок переглядів статей (повнотекстові перегляди статей, включаючи перегляди HTML, завантаження PDF та ePub, відповідно до наявних даних) та подання тез на платформі Vision4Press.

Дані відповідають використанню на платформі після 2015 року. Поточні показники використання доступні через 48–96 годин після публікації в Інтернеті та оновлюються щодня по днях тижня.

Початкове завантаження метрик може зайняти деякий час.