ЗНАЧЕННЯ НОВОЇ МИШИ NLRC5 У РІЗНИХ МОДЕЛЯХ ЗАПАЛЕННЯ КОНБАТУ

Клініка внутрішніх хвороб I (керівник: проф. Д-р Стефан Шрайбер) в Університетському медичному центрі Шлезвіг-Гольштейн, Кампус Кіль при Університеті Крістіана Альбрехтса в м. Кіль. Факультет Крістіан-Альбрехтс-Університет Цюль презентував НІКОЛІНА ЛАРА БОТТЧЕР з Кіль Кіль 2012

значення

1. Доповідач: проф. Розенстіель 2-й репортер: проф. Grassl День усного іспиту: 18 грудня 2013 р. Схвалено до друку, м. Кіль, 13 листопада 2013 р. Підписано проф. Laudes

Цим я заявляю, що дисертація на тему «Значення нокаутованої миші Nlrc5 в різних моделях запалення вродженої імунної системи», окрім порад мого наукового керівника та інших викладачів, є моєю власною роботою з точки зору форми та змісту, і, крім тих, що Інших допоміжних засобів, перелічених у роботі, я не використовував Я позначив усі буквальні або змістовні уривки як такі. Я також стверджую, що я подав додану дисертацію лише в цій та жодній іншій докторській процедурі, і що цій докторській процедурі не передували жодні остаточно провалені докторські процедури. Місце, дата, підпис

i Зміст Список скорочень та термінів technici. iii Перелік рисунків. v Список таблиць. v 1 вступ. 1 1.1 Запальна хвороба кишечника. 1 1.2 Дослідження генетичних асоціацій у галузі хронічних запальних захворювань. 3 1.3 Аутозапальні захворювання. 4 1.4 Вроджена імунна система та рецептор розпізнавання образів. 5 1.4.1 Асоціації генів сімейства Nod-подібних рецепторів з хронічними запальними захворюваннями. 7 1.4.2 Родина нодоподібних рецепторів. 8 1.5 Випуск. 11 2 Матеріал та методи. 13 2.1 Матеріал. 13 2.2 Миші. 13 2.3 Досліди на мишах. 14 2.3.1 Підготовка миші. 14 2.3.2 Ендотоксинний шок. 14 2.3.3 Коліт, спричинений DSS. 15 2.4 Виділення тканин/клітин миші. 17 2.4.1 Виділення ДНК із хвостів миші. 17 2.4.2 Макрофаги, отримані з кісткового мозку (BMDM). 17 2.4.3 Легкі. 19 2.4.4 Стимуляція. 19 2.5 Молекулярно-біологічні методи. 20 2.5.1 Виділення РНК із тканини. 20 2.5.2 синтез кдн. 21 2.5.3 Ланцюгова реакція зворотної транскриптази-полімерази (RT-PCR). 21 2.5.4 Електрофорез в агарозному гелі. 22 2.5.5 ПЛР у режимі реального часу. 23 2.5.6 ІФА. 23 2.6 Гістологічні методи. 24 2.6.1 Підготовка. 24 2.6.2 Фарбування ВІН. 24 2.7 Статистика. 25 3 результати. 26-й

ii 3.1 Nlrc5. 26 3.1.1 Геномна організація мишачого Nlrc5. 26 3.1.2 Профіль вираження Nlrc5. 27 3.1.3 Регулювання Nlrc5 за допомогою інтерферону-γ. 27 3.2 Підтвердження нокауту. 28 3.3 Базальне фенотипування миші, видаленої Nlrc5. 29 3.3.1 Базальна гістологія кишкових органів. 29 3.3.2 Базові лабораторні значення. 32 3.4 Моделі провокації. 33 3.4.1 Ендотоксинний шок. 33 3.4.2 Стимуляція LPS in vitro. 35 3.4.3 Коліт, спричинений декстраном натрію сульфатом (DSS). 36 4 Обговорення. 42 4.1 Миша, видалена Nlrc5. 42 4.2 Експресія та індукція мишачого Nlrc5. 43 4.3 Видалення Nlrc5 захищає в моделі гострого запалення. 44 4.4 Посилене запалення миші, видаленої Nlrc5, при коліті, спричиненому DSS. 47 4.5 Дихотомічний ефект Nlrc5 у різних моделях запалення. 49 4.6 Перспектива. 53 5 Резюме. 55 Бібліографія. 56 Додаток Використані матеріали. 61 Подяка. 63 CV. 64

iv RIG RLR RNA Rpm RPMI-1640 RT-PCR sirna SD SEM Tab.TAE Taq TH TLR TMB TNF Tube Well WT Індукований ген ретиноевої кислоти Ген ретиноевої кислоти (RIG) як рецептор Рибонуклеїнова кислота Кількість в хвилину Меморіальний інститут Розуелл Парку, середовище культури клітин Ланцюгова реакція зворотної транскриптази-полімерази Невелика заважаюча рибонуклеїнова кислота Стандартне відхилення Стандартне відхилення середнього значення Таблиця Tris-Acetat-EDTA Termophilus aquaticus T-допоміжна клітина Tll-подібний рецептор Тетраметилбензидин Фактор некрозу пухлини Пластикова реакційна посудина Добре в реакційній пластині Миша дикого типу або миші Як часто зустрічається в Англійські терміни курсивом у цій роботі. Для точнішої диференціації гени також пишуться курсивом, на відміну від білків, а маленькі літери використовуються для мишачих компонентів, а великі літери для людей. У цій роботі в основному використовується поточна номенклатура Комітету генної номенклатури організації геном людини від 2008 року. Виняток становить термін Nod-подібний рецептор, який використовується для домену, що зв'язує нуклеотиди, і сімейства, що містить багато лейцину, завдяки своїй популярності.

Вступ 12 Проведено ендотоксиновий шоковий тест, в якому інтерлейкін-1 відіграє важливу роль. З іншого боку, була використана комплексна модель експериментального коліту, яка включає як гостру фазу з механізмами загоєння ран, так і хронічну фазу із стимулюванням адаптаційної імунної відповіді. У цій дисертації досліджувались наступні питання: Чи може гостра або хронічна запальна реакція змінюватися in vivo генетичним дефіцитом Nlrc5? Як делеція Nlrc5 впливає на відповідь цитокінів при гострій та хронічній запальній реакції? Як структурна схожість Nlrc5 з іншими нодоподібними рецепторами, відомими своєю приналежністю до певних захворювань, впливає на його роль у вродженій імунній системі?

Матеріал та методи 25 секунд 70%, 80% та 90% ізопропанолу, потім 2 х 5 хвилин 100% ізопропанолу). Потім слідували 3 хвилини гідролу як органічного розчинника та покриття в еукітті покривним ковзанням. 2.7 Статистика Дані оцінювали за допомогою програми GraphPad Prism, GraphPas Software, La Jolla, США. Потім цю програму використовували для створення графіків.

Результати 30 досліджених змін. Однак острівці Лангерганса виявилися незмінними. Якщо значення креатиніну у мишей, видалених Nlrc5, знизили, нирки також досліджували більш ретельно, клубочки та канальці залишалися незмінними. Загалом миші, видалені Nlrc5, показали гістологічно без будь-яких відповідних змін щодо групи порівняння мишей дикого типу.

Результати 31 селезінка Nlrc5 -/- миша дикого типу миші (C57BL/6) легені товста кишка лімфатичні вузли нирка підшлункова залоза Рис. 7: Базальна гістологія миші, видаленої Nlrc5, та миші дикого типу фарбування ВІН не показало відповідних відмінностей.

Результати 40 мають значення. Після обробки кдн вимірювали експресію виділених цитокінів за допомогою ПЛР у режимі реального часу. З 0,0024 відносними одиницями експресія інтерлейкіну-1β збільшилася в 1,7 рази у мишей, видалених Nlrc5 (миші дикого типу: 0,0014). Експресія інтерлейкіну-18 (1,8-кратна), KC (1,4-кратна) та інтерферону-γ (1,7-кратна) також була виявлена ​​в товстій кишці мишей, видалених Nlrc5, порівняно з товстою кишкою мишей дикого типу. Миші збільшувались через 30 днів DSS-коліту. На відміну від цього, TNF-α був знижений. Вміст кдн 0,0006 у видалених Nlrc5 мишей виявився в 0,6 рази нижче, ніж у мишей дикого типу (0,0011) (рис. 15). Інтерлейкін-12 демонстрував стабільну експресію.