Зв’язок між скупченнями окисно пошкоджених нуклеотидів та активними або відкритими нуклеосомами

предметів

реферат

Розподіл окисного пошкодження таких основ, як 8-гідроксигуанін (8-OH-Гуа), визначали на рівні роздільної здатності нуклеотидів за допомогою методу ПЛР, опосередкованого лігуванням. Відомо, що введення канцерогену нирці, нітрилотріацетату заліза (III) (Fe-NTA) викликає окислювальний стрес і подальше утворення 8-OH-гуа в нирках. Загальну геномну ДНК виділяли з нирок щурів з або без обробки Fe-NTA, а потім перетравлювали формамідопіримідиновою ДНК-глікозилазою (Fpg). В якості мішені ми зосередилися на гені ферменту, що відновлює ДНК, для тимінгліколю, Nth 1. Розщеплені сигнали були знайдені в екзоні 1 та екзоні 3, але не в екзоні 5. Нуклеосоми, збагачені пошкодженими нуклеотидами в цих регіонах, були дуже доступними для мікрококової нуклеази, особливо в нирках. Беручи до уваги функцію білкового сегмента, кодованого цими областями, ми обговорили молекулярний механізм обмеженого утворення пошкоджених нуклеотидів.

вступ

Реактивні форми кисню (АФК) індукують різні типи пошкодження ДНК, наприклад, одноланцюгові розриви, дволанцюгові розриви, модифікації основ, включаючи ділянки апурину та апіриміду, та поперечне зшивання ДНК-білок (Dizdaroglu, 1991, 1992; Halliwell and Aruoma, 1991)). Вважається, що окисне пошкодження клітинних геномів відіграє певну роль у раку та старінні (Akman et al., 1991; Basu et al., 1989; Feig et al., 1994; Loeb et al., 1988; Maccabee et al., 1994; Макбрайд та ін., 1991; Морія та ін., 1991; Ткешелашвілі та ін., 1991; Вайцман та Гордон, 1990; Вуд та ін., 1990). 8-Гідроксигуанін (8-OH-Гуа) є основною формою окислювального пошкодження ДНК (Kasai and Nishimura, 1993; Umemura et al., 1990), що головним чином індукує GC → TA-трансверсії в клітинах Escherichia coli та ссавців (Cheng et al. 1992). Варіації кількості 8-OH-гуа в клітинній ДНК можна виміряти за допомогою ВЕРХ-ECD (Floyd et al., 1986; Kasai, 1997). Однак взаємозв'язок між індукованим пошкодженням ДНК та мутаційними спектрами не з'ясовано, оскільки відповідний метод виявлення пошкоджених нуклеотидів у ДНК in vivo ще не встановлений.

Нещодавно ПЛР, опосередкована лігуванням (LM-PCR), зробила прорив у виявленні пошкоджених нуклеотидів на рівні роздільної здатності нуклеотидів (Denissenko et al., 1996). LM-PCR спочатку був розроблений для геномного секвенування, включаючи виявлення місць метилювання CpG, а також для слідів in vivo (Konishi et al., 1995; Mueller and Wold, 1989, 1991; Nomoto et al., 1995; Пфайфер та ін., 1989). З тих пір він застосовується для аналізу місць розщеплення нуклеаз, наприклад, розщеплення мікрококової нуклеази або ДНКази I, для дослідження хроматину (Kato et al., 2000).

Білковий сегмент, кодований екзонами 1 і 2, унікальний для Nth 1 ссавців і містить ядерні та мітохондоріальні сигнали націлювання та передбачувані місця взаємодії для інших компонентів відновлення. Білковий сегмент, відповідальний за біфункціональну ферментативну активність, активність ДНК-глікозилази та активність АП-ліази, кодується екзонами 3-6. Для того, щоб визначити молекулярний механізм обмеженого утворення пошкоджених нуклеотидів в екзонах 1-4, ми проаналізували структуру хроматину печінки, нирок та селезінки у контрольних щурів. Нуклеосоми в екзонах 1-4 гена Nth 1 були легко доступні для MNase, особливо в нирках. Це спостереження може надати вказівку на сприйнятливість до канцерогенезу нирок.

Результати

Регіонально обмежене утворення пошкоджених нуклеотидів у гені Nth 1

скупченнями

Розподіл пошкоджених нуклеотидів у гені Nth 1. ( a ) Розподіл розщеплених піперидином або розщеплених Fpg місць на геномній ДНК з нирок у зазначений час після лікування Fe-NTA або контрольної нирки без лікування аналізували за допомогою LM-PCR. Геномна ДНК з нирок контрольних тварин також реагувала з DMS, потім перетравлювалась піперидином і використовувалася як гуанінова (G) драбина. Показані профілі розщеплення нетранскрибованого ланцюга в екзоні 1 гена Nth 1. "Txn" вказує на позицію попереднього стартового сайту транскрипції. ( ) Розподіл перетравлених Fpg місць на геномній ДНК, як описано вище. Показані профілі розщеплення нетранскрибованого ланцюга в екзоні 3 гена Nth 1. ( c ) Показано розподіл сайтів, засвоюваних Fpg, на нетранскрибованому ланцюжку в екзоні 5 гена Nth 1

скупченнями

Короткий зміст пошкоджених нуклеотидів у гені N-го 1. Порівнюються послідовності мишей (M) та щурів (R). Похідні амінокислоти можна побачити вгорі (миша) і внизу (щур). Нуклеотидні розбіжності між мишачими та щурячими послідовностями генів Nth-1 позначені перевернутими (заповненими квадратними) чорними літерами. Виведені заміни амінокислот також позначені перевернутими (заповненими квадратними) чорними літерами. Пошкоджені нуклеотиди гена Nth-1 щура позначені червоним кольором; Перевернуті (заповнені квадратні) червоні літери вказують на пошкоджені нуклеотиди, які були виявлені на нетранскрибованій нитці, тоді як квадратні червоні літери означають ті, які були виявлені на транскрибованій нитці. Підкреслення в екзоні 1 вказує на попередній мітохондріальний цільовий сигнал, тоді як в екзоні 2 вказує на передбачуваний сигнал локалізації ядер. Квадрат Lys в екзоні 4 позначає активний сайт активності ДНК-глікозилази, тоді як квадрат Asp в екзоні 5 позначає активний сайт активності АП-ліази

Організація структур хроматину в гені Nth 1

пошкоджених

Фарбування бромідом етидію фрагментів, перетравлених мікрококковою нуклеазою (MNase). Хроматини, що продукуються з печінки, нирок та селезінки, перетравлювались МНазою, як зазначено (Од/мл), а після екстракції ДНК, як описано в Матеріали та методи, перетравлені фрагменти ДНК електрофорезували на 1,5% агарозному гелі

пошкоджених

Аналіз місць розщеплення мікрококової нуклеази (MNase) в гені Nth 1. Фрагменти ДНК, засвоєні мікрококової нуклеазою, отримані з печінки, нирок та селезінки, як описано на рис. 3, аналізували за допомогою LM-PCR. Доріжка з написом "G-драбина" являє собою гуанінову драбину, як описано на малюнку 1. Розрахункове положення фази нуклеосоми показано на правій стороні панелі. ( a ) Розподіл місць розщеплення мікрококової нуклеази в екзоні 1 гена Nth 1. "Txn" вказує на позицію попереднього стартового сайту транскрипції. ( ) Розподіл таких у екзоні 3 гена Nth 1. ( c ) Розподіл таких у екзоні 5 гена Nth 1

обговорення

Білковий сегмент, кодований екзонами 1 і 2, унікальний для Nth 1 ссавців і, як вважають, містить ядерні та мітохондріальні цільові сигнали та місця взаємодії для інших компонентів системи відновлення (Ikeda et al., 1998). Нещодавно Klungland та співавт. (1999) показали, що білок XPG активує людину та S. pombe Nth 1 і стимулює зв'язування білка Nth 1 із ураженою ДНК шляхом опосередкованої взаємодії між Nth 1 та XPG. Активації або стимуляції XPG для E. coli Nth 1 не спостерігалося. Тому мутації в цих регіонах можуть призвести до аномальної внутрішньоклітинної локалізації мутованого білка Nth 1 або порушення.

Матеріали та методи

Тварини

Шість тижнів самців щурів Wistar були придбані у експериментальної тварини Seiwa (Фукуока, Японія). Їм давали комерційну чау-чау (Кліа, Токіо, Японія) та водопровідну воду за бажанням і використовували через 4 дні акліматизації.

Хімічні речовини та Fpg

Fe (NO 3) 3, Na 2 NTA та комплект ДНК-екстрактора WB були придбані у компанії Wako Biochemicals (Осака, Японія). Піперидин та диметилсульфат (DMS) були з Накала-Теске (Кіото, Японія). Розчин нітрилоацетату заліза (Fe-NTA) був безпосередньо перед використанням згідно з методами Awai et al. (1979) з незначними змінами. Коротко кажучи, Fe (NO 3) 3 і Na 2 NTA розчиняли у воді Milli-Q, а потім змішували при молярному співвідношенні 1: 4. РН доводять до 7,4 за допомогою NaHCO 3. Fpg отримували у компанії Trevigen (№ за каталогом 4040-100-01). Геномна ДНК перетравлювалася Fpg згідно з інструкціями виробника.

Лікування Fe-NTA

Загалом 30 тварин були розділені на Fe-NTA та контрольні групи. У групі Fe-NTA вони були вбиті через 1, 6, 24, 72 та 120 годин після ін'єкції Fe-NTA (15 мг Fe/кг маси тіла ip). У контрольній групі вони були вбиті без лікування. Кожна підгрупа містила по п’ять тварин. Тварин приносили в жертву під ефірною анестезією. Нирки негайно видаляли, а потім використовували для експериментів. Частина органу була заморожена і зберігалася при -80 ° C.

ПЛР, опосередкована лігуванням (LM-PCR)

ДНК витягували з нирок щурів (100-200 мг), використовуючи набір ДНК-екстрактора WB за методикою Nakae et al. (1995). Вилучену ДНК перетравлюють Fpg, як описано вище, або перетравлюють 1 М піперидином протягом 30 хвилин при 90 ° C (Maxam and Gilbert, 1977). Фермент Fpg розпізнає формамід піримідинів, отриманих з аденіну, гуаніну або 8-OH-гуа, а також деякі окислені піримідинові продукти, такі як 5-гідроксицитозин та 5-гідроксиурацил (Tchou et al., 1994). З іншого боку, хімічний реагент піперидин може розщеплювати багато типів похідних нуклеотидів, включаючи 8-OH-гуа та споріднені сполуки (Chung et al., 1992), а також різні типи похідних, отриманих хімічними реакціями Максама та Гілберта. Як контрольна гуанінова драбина, аликвота геномної ДНК від контрольних тварин реагувала з DMS і розщеплювалась піперидином, як описано вище. LM-PCR проводили, як описано раніше (Konishi et al., 1995; Nomoto et al., 1995). Позиції нуклеотидів сигналів розщеплення, отриманих з продуктів LM-PCR, визначали на основі контрольної гуанінової драбини та інформації про послідовність гена Nth-1 щура.

Інформація про послідовність кДНК Nth-1 щура охоплює лише фрагмент 3'-329 bp (GenBank H33255). Послідовність гена Nth-1 щура, необхідна для проектування праймерів для LM-PCR, була отримана з геномних продуктів ПЛР щурів, ампліфікованих праймерами на основі нуклеотидних ділянок між кДНК Nth-1 були збережені у мишей та людей (Aspinwall et al., 1997; Hilbert et al. 1997). Нуклеотидні послідовності окремих праймерів LM-PCR були наступними. Для екзону 1 гена Nth 1: праймер 1, 5'-gcctggagctaaagttccacg-3 '; Праймер 2, 5'-cccctgcaggcgcagcg-3 '; Праймер 3, 5'-ccctgcaggcgcagcgctacCTGC (великі літери вказують послідовність екзона). Для екзона 3: праймер 1, 5'-gtagtcagagatgcctgcctc-3 '; Праймер 2, 5'-ctccagaacagtgccccctcttgg-3 '; Праймер 3, 5'-ccagaacagtgccccctcttggttctgttgcc-3 '. Для екзона 5: праймер 1, 5'-Cagcaggatacctctctccc-3 '; Грунтовка 2, 5'-CaccaagctacactacCTGGGTAGCC-3 '; Грунтовка 3, 5'-ccaagctacactacCTGGGTAGCCACTCTTCCAGG-3 '. Праймери 1 та 2 використовували для синтезу першої ланцюга та ампліфікації ПЛР відповідно. Праймери 3 позначали на 5 'кінці γ- 32 P-ATP і використовували для остаточного виявлення сходів.

Травлення мікрококковими нуклеазами

Фракції хроматину з печінки, нирок та селезінки від контрольних щурів отримували, як описано (Gorsky et al., 1986; Goldhamer et al., 1995). Суспензія хроматину в буфері для травлення, 15 мМ трис-HCl (рН 7,5), 15 мМ NaCl, 60 мМ KCl, 1,5 мМ DTT, 0,15 мМ спермідину, 0,34 мМ сахарози, 0,1 мМ PMSF та 1 мМ М CaCl 2 розщеплювали послідовними розведеннями мікрококкової нуклеази (Worthington Biochemical Corp.) при 20 ° C протягом 5 хвилин. Після описаної вище екстракції ДНК 5-кінці ділянок, розщеплених МНазою, фосфорилювали Т4-полінуклеотид-кіназою та холодним АТФ (McPherson et al., 1993; Truss et al., 1995). Електрофорез вилученої ДНК проводили на 1,5% агарозному гелі. Зразки ДНК піддавали LM-PCR, як описано вище.

день подяки

Ця робота була підтримана грантами на дослідження раку від Міністерства освіти, культури, спорту, науки та технологій Японії та Товариства раку Фукуока, Фукуока, Японія.