11-21% вуглеводів 01% жиру 0,1 2% білків

Застосування мембранних адсорберів та скринінгових систем для цілеспрямованої переробки картопляних білків Томас Шепер, Ален Граф, С. Бейтель, М. Лоц, Р. Ульбер Лейбніц Університет Ганновер Калінстр. 3 30167 Ганновер, Німеччина 1

Значення картоплі Близько 220 диких видів та близько 2000 сортів, відомих сьогодні у всьому світі Світовий урожай близько 300 млн т щороку в 2004 р. В ЄС 2,7 млн га площі обробітку; Урожайність 65 млн т Приблизно 30% крохмальної картоплі (25-30 різних сортів) Операція кампанії (столова картопля з червня по вересень; крохмальна картопля з серпня по січень) 2

Інгредієнти крохмальної картоплі 11-21% вуглеводів 01% жиру 0,1 2% білків 2% клітковини 72% води амінокислот, вітамінів та мінералів вода 72% картоплі амінокислот 2% крохмалю 20% білка 2% інших інгредієнтів 2% клітковини 2% 3

Промислове виробництво крохмалю (крохмаль Емсланд) Картопля Картопляна промивка Терка Графін Зворотний осмос Крохмаль і клітковина Високобілковий вторинний потік Сепаратор (вимивання крохмалю) Картопляна фруктова вода (KFW) Крохмаль 4

Додана вартість картопляного білка Приблизно 6 млн. Т KFW в Європі Вода 94% Картопляна фруктова вода Амінокислоти 2% Інші компоненти 2% З точки зору цифр, близько 120 000 т картопляного білка Крохмаль 0,5% Білки 2% Склад білків KFW: 40% пататин (основний глікопротеїн ) 50% інгібіторів протеази (незначні білки) 10% високомолекулярних білків (поліфенол оксидази, кінази, фосфорилази) 5

Пататин-глікопротеїди, що складаються з 362 амінокислот (багатих лізином і тирозином) MW = 40-44 кда, pi = 4,5-5,2 (ізоформи з різними моделями глікозилювання) Ферментна активність: активність ліпід-трансферази, активність ліпід-ацилгідролази, активність естерази, Осборн і Кемпбелл, J. Am. Chem. Soc. 1986, 18, 575 Jacusen and Foote, J. Food Biochem. 1980, 4, 43 6

Група інгібіторів протеази (ІП) Гетерогенний клас термостійких багатих цистеїном білків МВт = 4-23 кда; pi = 5,1-9,0 90 Відіграють роль у захисті рослини від шкідників тощо. Інгібуючий вплив на серин та протеїназу цистеїну Сприяють насиченню (інгібітор протеази II) Можливий антиканцерогенний ефект 7 Kennedy et al., Pharmacol. Тер. 1998, 78, 167-209. Pouvreau et al., J. Agri and Food Chem 2001, 49 (6), 2864 Hill et al., Physiol and Behav. 1990, 48, 241

Використання фракцій білка картоплі Нутріцевтики Дитячі та спеціальні продукти харчування Спортивне харчування (Amino Mass) Маркетинг як засіб для зниження апетиту (Satise) Медичне застосування Лікування діабету II та раку шкіри 8

Нутрицевтики Продукти харчування з позитивним фізіологічним ефектом Боротьба з хворобами/профілактика, а також підвищення ефективності/добробуту Порівняно зі зростанням загального ринку продуктів харчування (1-3% на рік), обсяг ринку нутріцевтиків зростає приблизно на 8% щорічно (за оцінками світовий ринок 12 млрд євро ) Вимоги: смак хороший, практичний, зрозумілий ефект, недорогий, гарний вигляд 9

Створення цінності картопляного білка KFW Теплова коагуляція білків KFW забезпечує денатурований продукт Сучасний рівень Опади білка 110 C Немає біоактивності Маркетинг як низькоякісний корм для тварин Денатурована ціна картопляного білка за кг як картопляний білок Корм для великої рогатої худоби: 0,5 до 1 проста харчова добавка: 4 до 6 Vision KFW мембранний адсорберний процес фракціонований картопляний білок (природний), виділення біоактивних білкових фракцій (природний), маркетинг як високоякісні функціональні інгредієнти, приблизна ціна продажу за кг: приблизно 50 10

білкова суміш (білки зв'язуються відповідно до ізоелектричної точки) - -SO - 3 OS- 3 - -SO 3 - OS- 3 - -SO 3 - OS- 3 через розмір пір мембрани: приблизно 3,0 мкм товщина мембрани: 180-200 мкм плоский модуль (для аналітичних цілей) спіральний модуль (білок вниз за течією) вертикальний потік на поверхню мембрани вертикальний потік на поверхню мембрани

Різноманітність вихідних лігандів матеріалу (катіонні c-групи, 2+ 2+ антитіла, Ni, Cu) Основний матеріал (мембрана, кульки) умови переробки (наприклад, електричне поле) хімічна зв'язуюча речовина (альдегід, епоксидна смола)

цільовий білок-ліганд імуноглобулінів rt-pa, rh-gh glyc. білки стрептавідин His-tag-білки плазміди, білки білок А антитіло конканавалін А біотин Cu, Ni аптамери

Пластина, встановлена 8-лунковими смугами

Інтелектуальний скринінг завантаження зразків

катіоніт аніоніт білок A His-мітка антитіло Con A

додавання зразка на уловлювальну мембрану

катіоніт зразок 6 аніонообмінник зразок 4 білок A зразок 11 зразок His-tag 3 зразок антитіла 10 Con A зразок 1

01 0,1 02 0,2 03 0,3 04 0,4 05 0,5 06 0,6 07 0,7 08 0,8 09 0,9 10 1,0 11 1,1 12 1,2 катіоніт аніонообмінник зразок 6 зразок 4 білок A зразок 11 зразок His-tag 3 зразок антитіла 10 Con A зразок 1 градієнт хлориду натрію

Мембранний адсорбер, що збільшує масштаб Просте масштабування Різні геометрії та режими роботи Спінові модулі (1,9 7,5 см 2) До 2 мг білка/см 2 Сартобінд модулі (15, 75, 100 см 2) До 0,8 мг білка/см 2 24 Модуль Sartobind MultiSep-Module (0,1 80 м 2) До 0,8 мг білка/см 2

Поділ білка з використанням мембранних адсорберів Використання аніонних (Q) та катіонітних (S) мембранних модулів (Sartobind 15-100 см 2) Буфер A Буфер B LC насос нагнітальний клапан LC насос змішувальний елемент зразка мембранний модуль УФ-детектор Коефіцієнт провідності

Результати в лабораторних масштабах Q фракція: Пататин S фракція: білки Minore 2,00 1,0 1,75 100 0,9 100 1,50 80 0,8 80 а.е. [280 нм] 1,25 1,00 0,75 60 40 елюент у% AU [280 нм] 0,7 0,6 0,5 0,4 60 40 елюент у% 0,50 20 0,3 20 0,25 0 0,2 0 0,00 0 5 10 15 20 25 30 35 Час t в [хв] 0,1 0 5 10 15 20 Час t в [хв] Профіль завантаження та елюції модуля Q15 Профіль елюції модуля S15 26

Результати в лабораторних масштабах 1М розчину NaCl, завантажувальний об'єм 0,7 л/м2, здатність до зв’язування площі мембрани S адсорбер: 0,67 мг/см² Q адсорбер: 0,23 мг/см² 27

Поділ білка за допомогою мембранного адсорбера SDS-PAGE (трис-HCL, 18%, фарбування Кумасі) Доріжка 1: Маркер молекулярної ваги lk Доріжка 2: Картопляна фруктова вода, розведена 1:10 Доріжка 3 та 4: Фракція елюції (0,5 М NaCl, Q 15) Доріжка 5: Промити фракцію 6: Фракція елюції (0,5 М NaCl, S 15) 28

Характеристика Q-фракції - MALDI-MSMS 29

Характеристика S-фракції - MALDI-MSMS 4153 7879 7857 Пригнічувач апетиту: SATISE S-фракція Інгібітор Куніца KI Bowman Birk-інгібітор BBI-інгібітор карбоксипептидази CPI 20305 100 4271 інтенсивність [%] відносна Int 80 60 40 20 4144 3890 4292 8058 10101 20227 KI BBI CPI 0 пригнічувач апетиту 5000 10000 15000 20000 25000 маса (m/z) 30

Збільшення масштабу до масштабу процесу Модулі Sartobind (15, 75, 100 см 2) Модулі Sartobind MultiSep (6600 см 2) 31

Інноваційний мембранний процес подальшого потоку твердих речовин первинного освітлення/мікрофільтрації KFW (білки, крохмаль, волокна тощо) адсорбція мембрани депротеїнізований KFW (Q) - адсорбція мембрани 6600cm² (S) адсорбція мембрани 6600cm² депротеїнізований KFW елюат елюату розчин солі ультра/діафільтрація розчин солі ультра/діафільтрація Ретентатна ліофілізація/розпилювальна сушка ліофілізація/розпилювальна сушка інгібітори пататин-протеази xx.xx.2007 32

Результати на етапі процесу масштабування процесу V [L] t [хв] P [бар] Урівноваження 5 32 3,2 20 2,0 (20 мм NaPP, ph 7) KFW завантаження 10 5,6 2,2 (мікрофільтроване, 1: 5 розбавлений, ph 6,5) Промивання (20 мм NaPP, ph 7) 10 4,2 2,2 Модуль елюції Q 7,5 3,0 0,8 (0,5 M NaCl) Модуль елюції 6,0 2,3 1,0 (0,5 М NaCl) регенерація мембрани (1 М NaCl) 5,0 2,0 0,8 Зв'язуюча здатність S-адсорбера: 1,00 мг/см² (мала: 0,67 мг/см 2), Q-адсорбер: 0,37 мг/см2 (малий: 0,23 мг/см 2) 33

Для отримання мембрани площею 1 м2 (в даний час може бути досягнуто зв’язування та елюція 80% білків, що містяться в KFW): - 3,7 г пататину - 10 г інгібіторів протеази - це займає 20-25 хвилин, збільшення площа мембрани не призводить до збільшення часу. Використовуйте KFW 1: 5 розведеним 5 л на 1 м 2 xx.xx.2007 34

Гель та капілярний електрофорез Аналіз продукту Фракції промивання Фракції елюції Au (214 нм) S фракція Q фракція kda 100 85 70 60 50 40 30 KFW Q мембрана S мембрана 25 20 0 5 10 15 20 25 Час міграції [хв] Аналізи ферментативної активності 15 M пататина (Ліпід-ацилгідролаза) тест на пататин Визначення активності інгібітора протеази щодо трипсину Аналізи активності поліфенол-оксидази l ität 35 PI

Втручаючі компоненти: Глікоалкалоїди в основному містяться в шкірці картоплі та мікробах 20-2525 мг/100 г свіжого продукту як токсичний поріг Симптоми: біль у горлі, нудота/блювота, діарея, спазми шлунку та кишечника, головний біль, лихоманка, задишка, запаморочення, втрата свідомості D-галактоза N D- Глюкоза N HO HO OH L-глюкоза O β O OH OH OH O β OO HO α O CH 3 OH OH L-рамноза α-соланін: МВ 868,08 г/моль H 3 C HO HO O L-рамноза α O HO OH OH OO α HO β OO CH 3 OH OH L-рамноза α-хаконін: МВ 852,08 г/моль 36 maga; Крит. Rev. Food Sci Nutr 1980; Лі, 12 (4), 371 та ін; J Agric Food Chem.2004; 52 (10), 2832

ВЕРХ аналіз глікоалкалоїдів Картопляний білок (фракція) екстракція оцтовою кислотою Очищення твердофазною фазою ВЕРХ Аналіз Результат 0,15 Соланін стандартний Чаконін стандартний Екстракт білка картоплі АС (200 нм м) 0,10 0,05 Хаконін ланін Так 000 0,00-0, 05 0 5 10 15 20 25 30 35 Час утримання [хв] Кількісне визначення глікоалкалоїдів до 20 ppm, фракції, отримані через мембранні адсорбери, не містять алкалоїдів ! 37

Висновок Картопляна фруктова вода містить велику кількість біологічно цінних білків. Дотепер білки отримували денатурованими шляхом коагуляції теплом (корм худобі). За допомогою інноваційного мембранного процесу білки можна обережно фракціонувати та виділяти в біоактивній формі можливий промисловий масштаб 38

Промислове виробництво крохмалю та білка Картопля Промивання картоплі Терка Графін Зворотний осмос Крохмаль та волокнисті матеріали KFW Сепаратор (вимивання крохмалю) Інноваційний мембранний процес Осадження білка 110 С Крохмальний фракціонований картопляний білок (рідний) Денатурований картопляний білок xx.xx.2007 39

Виробництво білка Картопляна фруктова вода Мембрана подальший процес Рідні біоактивні фракції білка Пататин Фракція інгібітора протеази Ферментна активність: активність ліпід-трансферази ліпід ацил-гідролаза активність естераза MW = 40-44 44 кда, pi = 4,5-5,2 5,2 xx.xx.2007 41 Інгібуючий вплив на серинову та цистеїнову протеазу MW = 4-23 кда; pi = 5,1-9,0

Огляд білкових фракцій Вміст білка [%] Молярна маса [кда] Пататин ti 38 40 (80) Інгібітор картоплі I (PI-1) 4,5 7,7-7,9 (39) Інгібітор картоплі II (PI-2) 22 10, 2 (21) Картопляний інгібітор аспартил-протеази (PAPI) 6 19,9-22 Картопляний інгібітор цистеїніл-протеази (PCPI) 12 20,1-22,8 Інгібітор картопляної куніц-протеази (PKPI) 4 20,22 Інші інгібітори серинової протеази (OSPI) ) 1,5 21-21,8 Інгібітор картопляної карбоксипетидази (PCPI) 1 4,3 Поліфенолоксидази (РРО) немає інформації 60; 69 Ізоферменти фосфорилази немає інформації 180-600 Синтези крохмалю немає інформації 140 Білок Кінази немає інформації немає інформації Лектин 1 65,5 xx.xx.2007 42

Відновлювана сировина Продукція сільського та лісового господарства, що використовується в непродовольчому секторі (особливо для виробництва біоенергії) Відходи сільського господарства Сироватка (переробка молока) Меляса (переробка цукрових буряків) Картопляна вода (виробництво крохмалю) Ulber; CIT 2005, 77 No4, 363 xx.xx.2007 43

Картопляний крохмаль Річне виробництво в ЄС 9,1 Міо крохмальна картопля містить вміст крохмалю до 21% (столова картопля приблизно 15%) Рис приблизно 70-7575%, пшениця 58-64%, кукурудза 60-70% Крохмаль складається з 20% амілози та 80% амілопектину Джерело: Асоціація крохмальної промисловості xx.xx.2007 44

Промислове виробництво крохмалю (крохмаль Емсланд) Картопля Картопляна промивка Терка Графін Зворотний осмос Крохмаль і клітковина Високобілковий вторинний потік Сепаратор (промиває крохмаль) Картопляна фруктова вода (KFW) Крохмаль xx.xx.2007

Використання крохмалю Технічна продукція (папір, клеї, будівельні матеріали, текстиль) 50% косметичних продуктів зараз використовується у харчовій галузі xx.xx.2007 46

Група інгібіторів протеази Білок Частка білка KFW [%] Молярна маса [kda] Інгібітор картоплі I (PI-1) 4,5 7,7-7,9 (39) Інгібітор картоплі II (PI-2) 22 10, 2 (21) Картопляний інгібітор аспартил-протеази (PAPI) 6 19,9-22 Картопляний інгібітор цистеїніл-протеази (PCPI) 12 20,1-22,8 Картопляний інгібітор протеази куніца (PKPI) 4 20,2 Інші інгібітори серинової протеази (OSPI) 15 1,5 21-21,8 Картопляний інгібітор карбоксипетидази (PCPI) 1 4,3 47

Якість картопляного білка Висока поживна якість: 120 обмеження: Триптофан 100 макс. Бал амінокислот (AAS) 80 чисто рослинна 60 висока частка глютаміну або г білка] Анфо [мг/г 40 ФАО/ВООЗ стандартний картопляний білок Emsland крохмаль 20 0 ФАО/ВООЗ- Рекомендація (1990): Виправлена засвоюваність білка AAS = AAS x справжня засвоюваність калу Ile Leu Lys Met + Cys Tyr Thr Trp Val Білок Перетравність біологічної цінності [%] AAS PDCAAS FAO/WHO/UNU Експертна консультація (1985), Вимоги до енергії та білка, Технічний звіт Серія 724. Всесвітня організація охорони здоров’я, Женева Яловичина 80 98 0,94 0,92 Яйце 100 98 100 1,00 100 1,00 Серія звітів 724. Світове коров’яче молоко 91 95 1,00 1,00 Соя 74 95 0,96 0,91 Пшениця 64 91 0,47 0,42 Картопля т 69-100 1,00 - Schaafsma, G. (2000), оцінка амінокислот з корекцією засвоюваності білка. Журнал харчування 130, 1865-1867 48

Характеристика Q групи - MALDI MSMS амінокислотноїпослідовності: 1 MATTKSFLIL FFMILATTSS TCAKLEEMVT VLSIDGGGIK GIIPAIILEF 51 LEGQLQEVDN NKDARLADYF DVIGGTSTGG LLTAMITTPN ENNRPFAAAK 101 DIVPFYFEHG PHIFNYSGSI LGPMYDGKYL LQVLQEKLGE TRVHQALTEV 151 AISSFDIKTN KPVIFTKSNL AKSPELDAKM YDICYSTAAA PIYFPPHHFV 201 THTSNGARYE FNLVDGAVAT VGDPALLSLS VATRLAQEDP AFSSIKSLDY 251 KQMLLLSLGT GTNSEFDKTY TAEEAAKWGP LRWMLAIQQM TNAASSYMTD 301 YYISTVFQAR HSQNNYLRVQ ENALNGTTTE MDDASEANME LLVQVGETLL 351 KKPVSKDSPE TYEEALKRFA KLLSDRKKLR ANKASH Триптичне травлення забезпечує пептидні маси, які відповідають теоретичному перетравленню Чітка ідентифікація пататину за допомогою порівняння бази даних xx.xx.2007 49

Характеристика S-фракції - інтенсивність MALDI-MSMS [%] 100 80 60 40 S 75 фракція

4300 Da інгібітор куніца (приблизно 20 кда) інгібітор карбоксипептидази (приблизно 4300 Da) фракція S 75

20305 Da 20 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 m/z xx.xx.2007 50

катіоніт аніоніт білок A His-мітка антитіло Con A

додавання зразка на уловлювальну мембрану

катіоніт зразок 6 аніонообмінник зразок 4 білок A зразок 11 зразок His-tag 3 зразок антитіла 10 Con A зразок 1

Пластина, встановлена 8-лунковими смугами

Переваги мембранної технології Висока продуктивність розділення та потужність Можливі м’які умови процесу Конвективна передача матеріалу, мінімізоване обмеження дифузії Висока пропускна здатність, скорочений час обробки 62