Аеробний посів крові (з антибіограмою відповідно) - Синево
Загальна інформація
Посів крові - це один з найважливіших і делікатних методів для мікробіологічної лабораторії. Кров, яка зазвичай є стерильною, виділяє та ідентифікує бактерію або грибок у посіві крові, має значне діагностичне значення 13 .
Бактеріємія - це присутність у крові бактерій від септичного спалаху або пошкодженої слизової. Часто бактеріємічний стан позбавлений клінічних проявів або супроводжується лише ознобом і лихоманкою, до яких можуть додаватися симптоми та ознаки стану, що спричинив бактерійні виділення.
Септицемія - це клінічний термін, який визначає важливу бактеріємію з нерегулярною, непередбачуваною та важкою клінічною еволюцією, що супроводжується ознобом, нерегулярною лихоманкою, токсикозом, гіпотонією, прострацією, поліморфними та різними висипаннями, тканинними або вісцеральними септичними метастазами. Тяжкість септичного синдрому залишає на задньому плані симптоми первинного інфекційного спалаху, до якого потрібно завжди прагнути 1 .
Мікроби, що беруть участь у:
Золотистий стафілокок, кишкова паличка та інші ентеробактерії, коагулазонегативні стафілококи (SCN), Pseudomonas spp, Streptococcus spp, анаеробні бактерії, дріжджі
Streptococcus spp., Enterococcus spp., Staphylococcus spp
Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae
Залежно від вхідних воріт:
Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae
Ентеробактерії, суворо анаеробні бактерії, Enterococcus spp.
Суворо анаеробні бактерії, E.coli, Enterococcus spp.
Інфекції та перешкоди сечовивідних шляхів
Ентеробактерії, Enterococcus spp.
Принцип посіву крові
Посів крові - це якісний тест для виявлення мікроорганізмів, що присутні в крові. Кров, взята в умовах суворої асептики, висівається у пляшку з посівом крові, склад якої сприяє розвитку аеробних, анаеробних та мікроаерофільних мікробів 11 .
Основними чинниками збагачення, включеними в навколишнє середовище, які сприяють розвитку мікробів, є:
- комбінація пептонів, казеїну та желатину для прийому амінокислот;
- дріжджовий екстракт для прийому вітаміну;
- гемін та NAD, що дозволяють розвивати гемофілус та сприяють росту поживних мікроорганізмів, таких як Actinobacillus spp, Cardiobacterium spp, Eikenella spp та інші анаероби;
- вітамін В6, незамінний елемент у розвитку стрептокока, дефіцитного при ендокардиті та стафілококу;
- CO2 важливий елемент для росту мікробів виду: Neisseria, Brucella, Haemophilus, Streptococcus, Campylobacter.
Однак розмноження бактерій також залежить від ряду факторів, незалежних від умов вирощування: щільності мікробів у крові, стадії їх розмноження, присутності в крові деяких інгібуючих речовин.
Бактеріємія та фунгемія дорослих зазвичай розвиваються при невеликій кількості циркулюючих мікроорганізмів (між 1-30 КУО/мл крові). У новонароджених, немовлят та маленьких дітей концентрація перевищує 100 КУО/мл. Загалом існує прямо пропорційна залежність між тяжкістю інфекції, прогнозом та концентрацією бактерій у крові. .
Бактерії, захоплені в пляшці для посіву крові, можуть бути:
- інтактний, вільний у плазмі, у фазі активного розмноження і буде продовжувати швидко ділитися у відварі культури крові або у фазі спокою і почне розмножуватися в кінці фази латентності, що відповідає адаптації до поживного середовища флакона;
- більш-менш пошкоджені або замасковані під дією системи антитіл-комплементу, антибіотиків, поліморфно-ядерного фагоцитозу або моноцитів і розвиватимуться після аутолізу лейкоцитів, якщо вони залишаться життєздатними;
- L-подібні бактерії (харчові дефіцити), для зростання яких необхідне пристосоване середовище (гіпертонічне та багате на фактори росту) 12 .
Ріст бактерій у посіві крові можна затримати або запобігти, якщо в поживному середовищі не застосовується антикоагулянт, оскільки мікроорганізми можуть потрапити у фібриновий згусток. У той же час деякі антикоагулянти можуть бути токсичними для певних збудників, як і антибіотики в крові. Ці перешкоди можна усунути, використовуючи поліанетолсульфонат натрію (SPS), нетоксичний антикоагулянт, який сприяє проліферації бактерій, нейтралізуючи бактерицидну активність сироватки крові людини та пригнічуючи дію антибіотиків (стрептоміцин, канаміцин, гентаміцин, поліміксин В). СФС може мати інгібуючу роль на штами Peptostreptococcus, Neisseria, ефект нейтралізований наявністю желатину в живильному середовищі.
На продаж виходять напівавтоматичні або комп’ютеризовані комп’ютерні системи для швидкого виявлення бактерій у посівах крові. Принципи, на яких базуються ці системи, різноманітні. Ми згадуємо лише ті, які ми використовуємо в лабораторії Синево: безпосереднє виявлення утворення СО2, шляхом:
-серійне сканування зразків газу, що є результатом розмноження бактерій у флаконі з посівом крові, як у системі BACTEC (BACTEC 9050);
-змушуючи культуральну рідину (під тиском вивільненого СО2) переходити в сигнальний відсік, звідки її можна дослідити мікроскопічно та субкультивувати, як у СИСТЕМІ ОХОЇДНИХ СИГНАЛІВ 9 .
Рекомендації щодо детермінації
Це робиться за показаннями лікаря в певних клінічних ситуаціях, таких як:
• усі випадки лихоманки неуточненого походження, особливо якщо супроводжуються клінічними ознаками, що свідчать про інфекцію;
• пацієнти з гострим ендокардитом;
• синдром, що свідчить про системне зараження специфічними мікробами (кишкова гарячка, бруцельоз, лептоспіроз);
• важкі локалізовані інфекції (менінгіт, пневмонія, внутрішньочеревні нагноєння).
Посів крові також мотивований:
• пацієнти з ослабленим імунітетом (рак, наркомани);
• пацієнт, який зазнав медичної агресії (катетер, діаліз або операція) і має фебрильний стан;
• у певних конкретних ситуаціях (вагітна жінка, серцевий пацієнт, діабетик, з нирковою недостатністю, печінковою недостатністю), коли у пацієнта лихоманка невстановленого походження 8 .
Підготовка пацієнта
Відбір проб проводять перед антимікробною обробкою, відповідно до прогнозного розвитку кривої гарячки або коли пацієнт сигналізує про появу ознобу. Якщо це неможливо, кров забирають безпосередньо перед введенням нової дози антибіотика. Показано взяти три переривчасті проби протягом 24 годин; в надзвичайних ситуаціях ритм дорівнює інтервалу 30-60 хвилин 6 .
Зібраний зразок - венозна кров, бажано натще (натщесерце), гіперліпемія може запобігти появі бактеріального росту в рідкому середовищі.
Область вибору для пункції представлена венами ліктя. Процедура відбору проб дотримується норм асептики та антисептики, необхідних для уникнення зараження зразка бактеріями, що мешкають у шкірній флорі. Після забору крові 10 мл зразка крові, зібраний у шприц, поміщають у контейнер із середовищем для посіву Signal шляхом проколювання його гумової кришки в умовах суворої асептики. Пляшку обережно струшують, щоб гомогенізувати її в масі середовища. Для системи BACTEC збирання проводиться в ємності для посіву крові за принципом вакуумно закритих систем.
Зразок маркується і транспортується якомога швидше від збору в лабораторію, при температурах, максимально наближених до 37ºC (ізотермічна коробка) 8 .
Необхідні матеріали - 10 мл стерильний шприц; флакон із культуральним середовищем Signal 8; флакон із культуральним середовищем (BACTEC PLUS AEROBIC/F та PLUS ANAEROBIC/F 4; 10; 14, BACTEC PÈDS PLUS ™/F 5, придатний для педіатричних зразків та невеликих об’ємів крові) для системи BACTEC.
Кількість зібраного - дорослий: 10 мл; дитина: 3-5 мл (сигнал) та між 3-10 мл у дорослого та 1-3 мл у дитини (BACTEC) 8 .
Причини відхилення доказів
• неправильно відібрані зразки (правила антисептики не дотримувалися);
• неправильний транспорт 8 .
Потрібна обробказ після збору врожаю - Сигнальна система: додається розширювальна камера, що поставляється в тому ж комплекті. Інкубуйте при температурі 37 ° C. Час інкубації в термостаті та за зразком становить у середньому 7 днів. Потрібна тривала інкубація у пацієнтів з підгострим ендокардитом, у зразках, відібраних під антибіотикотерапією (до 14 днів) або при дослідженні вимогливих мікроорганізмів 8 .
Система BACTEC: відскануйте штрих-код на пляшці до пристрою для зчитування штрих-коду та вставте пляшку у вказане положення. Після закриття дверей процес починається автоматично. Пристрій має ємність 50 пляшок. Він постійно спостерігає за флаконами з культурою крові, інкубованими при температурі 35 o C. Флакони постійно струшують для сприяння росту бактерій. Позитивні флакони подаються звуково та візуально. Система автоматично виконує контроль якості кожні 10 хвилин. Вбудоване програмне забезпечення управляє зразковими даними 2 .
Метод роботи
А. Для набору Signal-Oxoid; він складається з:
а) контейнер для сигнального середовища; склад цього середовища дозволяє розвивати аеробні, анаеробні та мікроаерофільні мікроби, що спричиняє підвищення тиску, виявлене за допомогою показника росту, пристосованого до пляшки (розширювальної камери);
б) камера розширення навколишнього середовища; у разі розмноження бактерій і підвищення тиску частина суміші крові/бульйону переходить в цю камеру і вказує на бактеріальну активність (позитивний посів крові) 4 .
Для проходження тестів використовується класичний метод:
• Макроскопічне - візуальне - огляд двічі на день пляшок з посівами крові на предмет виявлення ознак росту бактерій. Зовнішній вигляд флакона може бути спрямований на відповідну бактерію, наприклад:
а) помутніння - грамнегативні аеробні палички, Staphylococcus spp, Bacteroides spp;
б) гемоліз - Streptococcus spp, Staphylococcus spp, Lysteria spp, Clostridium spp, Bacillus spp;
в) газовидобуток - аеробні та анаеробні грамнегативні палички;
г) згустки - золотистий стафілокок.
• Мікроскопічне дослідження свіжого препарату та мазка, забарвленого за Грамом, проведеного з флакона з посівом крові.
Примітка: постійне перемішування контейнерів протягом перших 24 годин інкубації покращує ріст переважної більшості аеробних бактерій 9; 15 .
Інтерпретація культур у системі сигналів
Відсутність зростання - середовище в контейнері Signal залишається чистим і не проходить через зелений рукав розширювальної камери. У перші 6-12 годин інкубації можна зробити сліпі субкультури (інокуляція на шоколадному агарі в атмосфері СО2 при температурі 35 ° C ще протягом 48 годин або в тіазліколірованому відварі з резазурином) і мазки, які будуть фарбовані за Грамом (мікроскопічне дослідження).
Контейнери, що зростають за відсутності, будуть повторно інкубовані та подальший моніторинг.
Позитивна культура крові - якщо в досліджуваній крові є мікроби, які розмножилися в культуральному середовищі (позитивна культура крові), середовище перейде в камеру розширення і підніметься над її зеленим рукавом.
B. Для системи BACTEC принцип роботи такий:
Завдяки метаболічній активності мікроорганізми у флаконі виділяють CO2, а флакони, що містять маркер активації, який стає флуоресцентним при контакті з CO2, виявляють його присутність. Фотодетектор камери вимірює рівень флуоресценції і передає дані на комп'ютер. Вимірювання інтерпретується системою відповідно до попередньо запрограмованих параметрів позитивності. Комп’ютер визначає позитивний флакон, який подається на слух і візуально, запалюючи лампочку. Графічне положення позитивно виявленого флакона відображається на екрані пристрою.
Будучи повністю автоматичною системою, флакони контролюються кожні 10 хвилин, що дозволяє негайно виявити позитивні флакони .
Протокол моніторингу становить 7 днів, але розвиток мікроорганізмів можна виявити через 8 годин 2; 4; 10; 14 .
C. Позитивні культури крові обробляють наступним чином:
Сигнальна система: Невелика кількість середовища береться з нижньої області розширювальної камери. Доступ до розширювальної камери здійснюється через верхню її частину, через стерильний маневр. Цей маневр не може забруднити вміст контейнера Signal.
Система BACTEC: через голку, прикріплену до пляшки, відбирають кількість середовища, з якої роблять мазки і висівають на культуральні середовища 2 .
Вибране середовище використовується для:
а) розповсюдження мазків на мікроскопічних предметних стеклах; їх досліджують після фарбування за Грамом. По відношенню до результату показань робляться повтори.
б) трансплантація на тверді та рідкі середовища залежно від мікроскопічно засвідчених бактерій: агар-кров/колумбійська кров, агар-шоколад, Левін/МакКонкі, Сабуро з левоміцетином, тіогліколатовий відвар з резазурином.
в) пластинки інкубують, залежно від мікроскопічно опромінених бактерій, при температурі 35ºC-37ºC в аеробних умовах, в атмосфері з 5-7% CO2 або в анаеробіозі (GasPack + відновна суміш) протягом 48-72 годин. Досліджуються поодинокі колонії.
г) тести, необхідні для ідентифікації: ідентифікатор каталази, набір для ідентифікації стафілококів, набір для ідентифікації стрептококів, диски Оптокіна, фактори X, V і XV, політропні середовища для ентеробактерій, реакція оксидази, тести API (API 20E, API 20NE, API NH та ін.) тести для виявлення дріжджів. Ідентифікація також може бути здійснена автоматично в системі Vitek.
д) тестування на антибіотичну або протигрибкову чутливість дифузиметричним або автоматичним методом на Вітек 9 .
D. Випуск результатів
а) частковий результат мазком, пофарбованим за Грамом - його фіксують та повідомляють по телефону;
б) кінцевий результат після виділення, ідентифікації бактерії та дії антибіограми або протигрибкового препарату.
Інтерпретація кінцевого результату проводиться відповідно до клінічного контексту та кількості позитивних флаконів щодо зібраних 9 .
• кілька позитивних посівів крові з патогенним мікробом;
• кілька позитивних посівів крові із загальним коменсальним зародком у певному клінічному контексті;
• 1 позитивний посів крові з відомими патогенними мікробами (Salmonella spp);
• 1 позитивний посів крові з потенційно патогенними мікробами у викликаючому клінічному контексті, наприклад: Streptococcus pneumoniae при пневмонії, ентеробактерії при інфекціях сечовивідних шляхів, коагулаза-негативний стафілокок при катетерних інфекціях.
• 1 позитивний посів крові з коменсальним зародком без клінічного контексту: суперінфекція коагулазонегативним стафілококом, коринебактеріями, негрупувальним стрептококом;
• на пригніченому імунному полі ці бактерії також враховуються;
• на нормальному імунному полі посів крові повторюється.
• зразок відбирали після антибіотикотерапії;
• збирання проводили пізно під час захворювання (з’являються антитіла);
• недостатня кількість зібраної крові;
• час спостереження занадто короткий;
• Неправильно підібране культуральне середовище.
Позитивні посіви крові для кількох видів бактерій
Якщо декілька видів бактерій були виділені в одному флаконі або з різних флаконів одного і того ж пацієнта, вони спостерігаються в таких ситуаціях:
• катетер, що підтримується протягом тривалого часу.
Ізольовані види бактерій залежно від періоду вирощування
• у перші 1-2 дні ростуть: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus spp, ентеробактерії;
• через 3 дні ростуть: неферментативні грамнегативні палички, анаеробні бактерії;
• на 4-5 день: Haemophilus spp та коагулаза-негативний стафілокок;
• кожні 6-7 днів: види Candida;
• через 9 днів: коринебактерії 9 .
Межі та перешкоди
• антимікробна обробка, що застосовується перед відбором проб;
• зараження крові екзогенною флорою;
• недостатня кількість взятої крові;
• частота та час неправильно встановленого врожаю;
• неправильно підібране середовище інкубації та пересадки;
• невідповідний час інкубації 1; 6; 12 .
1. Akiyama H., Kanzaki H., Tada J., Arata J. Коагулазонегативні стафілококи, виділені з різних уражень шкіри. В D Dermatol, 25: 563-8. 1998. Тип посилання: Журнал (повний).
2. Becton Dickinson and Co., Bactec 9050. Системи для мікробіології Becton Dickinson, Sparks, Maryland 21152 USA, 1997
3. Думітру Буюк. Посів крові в діагностиці інфекції. У трактаті з клінічної мікробіології. Думітру Буюк, Маріан Негут, Медичне видавництво, Румунія, 2-е вид. 2008, 165-182.
4. Голденбаум П., Стаффорд Е., Талбот Б. Лабораторне дослідження нейтралізації антимікробних препаратів середовищем, що вміщує смолу, Шостий Європейський конгрес клінічної мікробіології та інфекційних хвороб, 1993, 28-31.
5. Харді Л., Кроутер Л., Голденбаум П., Біті С. . Шостий Європейський конгрес клінічної мікробіології та інфекційних хвороб, 1993, 28-31.
6. Джозеф М. Чіветта, Роберт В. Тейлор, Роберт Р. Кірбі. Критичний догляд. У Lippincott Raven за ред. 1997; 28: 405-412.
7. Koontz FP., Flint KK., Reynolds JK., Allen S. Багатоцентрове порівняння великих обсягів (10 мл) та BACTEC Plus та стандартних (5 мл) №. Система BACTEC. У діагн. Мікробіол. Заразити. Дис., 1991, 14: 111-8.
8. Кумар П.Дж., Кларк М.Л. У клінічній медицині. Bailliere Tindall, Великобританія, 2-е видання. 1990, 710-720.
9. Синевська лабораторія. Конкретні посилання на використовувану технологію роботи 2010. Тип посилання: Каталог.
10. Лев'євр Х., Гіменес М., Ванденеш Ф. та ін. Багатоцентрове клінічне порівняння пляшок, що містять смолу, зі стандартними аеробними та анаеробними пляшками для культури мікроорганізмів із крові. У Eur.J. Клін. Мікробіол. Infect.Dis., 1997, 16: 669-674.
11. Loulergue J., Avril J.L., Omwanga D. Гемокультури. Вивчення патологічних продуктів. Морі-Імпрімер С.А., вид. 1987, 41-45.
12. Філіпона А., Пол К., Невот П. Гемокультура. У Преподобному Праті, 33: 1929-38. 1983. Тип посилання: Журнал (повний)
13. Реймер Л.Г., Вільсон М.Л., Вайнштейн М.П. Оновлення щодо виявлення бактеріємії та фунгемії. У Клін. Мікробіол. Преподоб., 10: 445-465. 1997. Тип посилання: Журнал (повний).
14. Rohner P., Pepey Beatrice, Auckenthaler R., Перевага поєднання смоли з літичним середовищем культури крові BACTEC. У J. Clin. Microbiol., 1997, 35 (10): 2634-8