Чому і для кого швейцарський медичний журнал
резюме
Структурні геномні аномалії відіграють визначальну роль у патогенезі захворювань і часто зустрічаються у пацієнтів із порушеннями розвитку, синдромами мальформації, а також у пухлинній тканині. Каріотипування та флуоресцентна гібридизація in situ є стандартними інструментами для виявлення хромосомних перебудов, але ці підходи мають обмеження. Аналіз ДНК мікрочипів - це методологічна революція, яка дає можливість вивчити весь геном та виявити невеликі генетичні перебудови, не виявлені звичайними методами. Завдання цієї статті полягає в тому, щоб описати, чому застосування цієї нової методології на сьогоднішній день є вкрай важливим для етіологічних досліджень генетичних захворювань, які межі стандартних підходів та для аналізу ДНК-мікрочипів, який застосовуватиметься у дитячих клініках.
Історичний
Цитогенетичний аналіз є частиною етіологічної обробки у пацієнтів із затримкою розвитку та/або розумовою відсталістю, синдромами мальформа 1-3. З 1970-х років вдосконалюються технології та виявляються структурні хромосомні аберації. Описані нові синдроми, вони характеризуються постійним клінічним фенотипом, пов'язаним з однаковими геномними варіаціями, такими як, наприклад, синдром Прадера-Віллі, пов'язаний з делецією 15-ї хромосоми, в 15ql 1,2-ql3 або синдром Вільямса при делеції хромосоми 7, 7ql 1,23. 4
Чому підхід до мікрочипів?
Важливими обмеженнями стандартних технологій є те, що вони залежать від: 1) роздільної здатності техніки хромосомного аналізу та 2) супутньої клінічної інформації. Каріотип може виявити відхилення порядку від 4 до 5 мегабаз (Мб) (поріг роздільної здатності 500 смуг на гаплоїдний геном). Техніка флуоресцентної гібридизації in situ (FISH) дозволяє надалі роздільну здатність і виявляє перегрупування декількох сотень тисяч основ (kb) (рис. 1). Однак FISH можна застосовувати лише в тому випадку, якщо клінічна інформація є суперечливою, що свідчить про наявність відхилень в одній або декількох конкретних областях геному. Дійсно, визначити наявність генетичних відхилень у пацієнта, такого як, наприклад, пацієнт із синдромом Вільямса, можливо, лише якщо аналіз FISH націлений на область, що представляє інтерес, а саме область, аномальну в 7ql 1.23, пов’язану з цим синдрому.
Ось чому потрібен був новий діагностичний підхід. Його метою було виявлення хромосомного дисбалансу дуже малих розмірів у цілому геномі, і це не маючи конкретного клінічного виклику. Аналіз масиву CGH сьогодні відповідає на цей попит, народжується молекулярний каріотип (рисунок 1). Таким чином, можна провести загальногеномне дослідження з метою пошуку втрат або виграшів послідовностей ДНК. Роздільна здатність, в 100-1000 разів більша, ніж у звичайного каріотипу, дає можливість характеризувати субмікроскопічні структурні варіації, не виявлені звичайними методологіями, з роздільною здатністю в кілька тисяч основ (kb) (рисунок 1).
Принцип
Технологія "ДНК-чіпів" використовує принцип порівняльної геномної гібридизації (CGH) і складається з когібридизації однакової кількості ДНК від пацієнта та контрольного контролю, кожен з яких позначений флуорохромом іншого кольору, на масиві послідовностей ДНК. (ДНК-чіп), що представляє весь геном. Флуоресцентні сигнали зчитуються за допомогою автоматизованого лазерного сканера. Потім проводиться біоінформаційний аналіз даних із використанням програмного забезпечення, яке реєструє інтенсивність різних флуоресценцій. Після нормалізації цих даних складається графічний звіт із застосуванням програмного забезпечення з коефіцієнтами гібридизації, близькими до "0" для всіх регіонів без структурної аномалії (рис. 2). Значне відхилення цього значення за кількома сигналами однієї і тієї ж геномної області свідчить про наявність відхилень, втрати або збільшення ДНК. Цей аналіз повторюється протягом усього геному. Тоді можна побачити каріотип за допомогою збільшувального скла, що містить збільшення приблизно в 1000 разів (рисунок 1).
Обмеження підходу ДНК мікрочипів
Не всі виявлені варіанти є патогенними. Дійсно, нещодавно ми дізналися, що два випадкові геноми відрізняються один від одного кількома тисячами субмікроскопічних структурних перебудов. 5 Більшість із цих варіантів не мають патологічного впливу. Тому основним поточним обмеженням є виявлення неперевірених геномних варіантів. Складність полягає в тому, щоб розрізнити варіант, який можна вважати нешкідливим, оскільки без патологічних наслідків, та патогенний варіант. Тільки демонстрація зв'язку між геномними результатами, в даному випадку наявністю визначеного варіанту та описом детальної клініки, дозволить підтвердити клінічний характер цих варіантів у майбутньому. Зараз доступні конкретні бази даних, DECIPHER (DabatasE хромосомного дисбалансу та фенотипу у людей з використанням ресурсів Ensembl) та ECARUCA (Європейський реєстр асоціацій цитогенетиків неврівноважених аберацій хромосом), їх метою є надання інформації, важливої для розуміння спостережуваних геномних варіацій.
ДНК-чіпи: для кого?
Згідно з рекомендаціями Американського коледжу медичної генетики, аналіз мікрочипів слід застосовувати у поєднанні зі стандартним каріотипом, особливо для оцінки пацієнтів з розумовою відсталістю та/або аутизмом та/або вродженою аномалією. У педіатрії основні показання різних цитогенетичних аналізів узагальнені в таблиці 1. 6 Ця технологія також може застосовуватися як доповнення до результату нормального каріотипу та за наявності численних вад розвитку в областях неонатології та пренатальної діагностики.
Основні показання до цитогенетичного аналізу в педіатрії
У пацієнтів із затримкою розвитку та/або із затримкою психічного розвитку або синдромом мальформації стандартні методики дозволяють виявити хромосомну аномалію в 5-10% випадків, тоді як за допомогою діючих чіпів ДНК аномалія виявляється в 15-20% випадків. . 7 В останні роки ця нова методологія дозволила визначити нові синдроми, що представляють повторювані геномні аномалії, або у формі втрати (мікроделетні синдроми), або у формі посилення (синдроми мікродуплікації) (Таблиця 2). 8-11 Ці синдроми іноді мають особливість не проявлятися систематичними та/або сугестивними клінічними ознаками. Сьогодні клініцисти опиняються в ситуації зворотної семіології, коли генотип асоціюється з фенотипом, тобто, що з геномних аномалій, виявлених під час аналізу чіпсів ДНК, виявляється загальний фенотип між пацієнтами.
Приклади нових мікроделетарних та мікродуплікаційних синдромів (не вичерпних), виявлених шляхом аналізу мікрочипів ДНК та описаних відповідно до співвідношень генотип-фенотип
Аналіз ДНК мікрочипів у педіатричній практиці: досвід університетського лікарняного центру Во
В Університетському лікарняному центрі Во (CHUV) цей підхід застосовується з 2007 року в різних галузях педіатрії (медична генетика, молекулярна педіатрія, дитяча онкологія та прикладні дослідження). У контексті суб'єктів із затримкою психічного розвитку та/або затримкою розвитку за цією технологією було обстежено майже 200 пацієнтів. Приблизно в 30% випадків вдалося продемонструвати структурні коливання кількості геномних копій. Ці варіації можуть з’являтися як ново, так і успадковано. І для 20% усіх цих випадків виявлена перебудова була визначена як згубна причина хвороби пацієнта.
Практичні приклади
Визначення нового синдрому дублювання 7q11.23
Семирічну дитину направляють на оцінку в контексті затримки засвоєння (придбання ходьби у 27 місяців та мови у сім років обмежене кількома словами), міоклонічної епілепсії, гіперактивності. Жодної дисморфічної ознаки, крім наявності видатних вух. На МРТ головного мозку: незначна атрофія білої речовини, дисплазія гіпокампа та вентрикуломегалія. Стандартний каріотип - нормальний; Аналіз мікрочипів показує наявність дублювання 1,8 Мб області 7q 11,23 (рис. 3). Тест FISH у матері, яка також мала порушення мовлення, виявив те саме дублювання. Багатоцентрова співпраця дозволяє продемонструвати загальний фенотип для цієї мікродуплікації 7q 11,23. Загальними ознаками є гіпотонія, затримка мови, помірна розумова відсталість. Наявність інших ознак, таких як вроджені аномалії (стійка артеріальна протока (стійкий артеріальний проток - PDA), діафрагмальна грижа, крипторхізм, неспецифічні аномалії білої речовини) та дисморфічні особливості (короткий фільтрум та тонкі губи) дуже мінливі. 12
Визначення нового синдрому мікроделеції 16p11.2
Шістнадцятирічного підлітка направляють на захворювання із ожирінням (ІМ> 40). У попередніх відзначаються освітні розлади без розумової відсталості. Сімейний анамнез показує, що мати також страждає ожирінням з ІМТ> 40, для якого вона перенесла баріатричну операцію. Клінічне обстеження в основному виявляє ожиріння з acanthosis nigricans, що свідчить про гіперінсулінемію. Етіологічна обробка виключає мутацію гена MC4R, відповідального за патологічне ожиріння. Аналіз ДНК мікрочипів показує делецію 600 kb за 16p 11.2. В рамках сімейного опитування мати отримує обстеження, яке виявляє те саме видалення. Дослідження, що порівнювало частоту цього видалення у пацієнтів із ожирінням та контрольних груп, дозволило нам продемонструвати сильний зв'язок між ожирінням (із порушеннями нервово-розвиткового розвитку або без нього) та цією мікроспледезією на 16 пл 1,2. Остання, поряд з мутаціями MC4R, є однією з найпоширеніших генетичних форм важкого ожиріння. 13
Основні дослідження: техніка генного полювання
У п’яти сім’ях пошук молекулярної основи модісплазії, аутосомно-рецесивної хондродисплазії з короткими кінцівками та лицьового дисморфізму, спочатку проведений за допомогою аналізу зв’язку ДНК, щоб знайти ген, відповідальний за хворобу. Патогенну мутацію гена GPC6 можна виявити в одній родині. За допомогою аналізу мікрочипів ДНК геномні мікрореорганізації (три делеції та одна дуплікація) в гені GPC6 були виявлені в інших чотирьох сімействах. Ці втрати/виграші ДНК призводять до повної відсутності гліпікана 6, ключової молекули в передачі кількох клітинних сигналів, які регулюють ріст кісток. Цей тип перебудови, занадто великий, щоб його можна було виявити шляхом секвенування, і занадто малий, щоб його можна було побачити на каріотипі, може становити молекулярну патологію інших моногенних хвороб, відповідальний ген яких досі невідомий. 14
Пухлина: аналіз ДНК мікрочипів, прогностичне значення
У новонародженого, народженого в термін, є важка форма нейробластоми IVS, що вимагає інтенсивного лікування з інтубацією та підтримкою кровообігу. Біопсія печінки підтверджує хороший прогноз зі сприятливою гістологією та відсутністю ампліфікації онкогену MYCN за допомогою FISH. Після гарного початкового курсу прогресування захворювання діагностується за появою метастазів у черевні та грудні лімфатичні вузли. Постає питання про біологічну аномалію пухлинних клітин, яка досі не виявлена. Додатковий аналіз мікрочипів ДНК на всій геномі, проведений на тканині пухлини, виключає несприятливу підгрупу, що вимагає інтенсифікації лікування. 15,16 За умови простої хіміотерапії результат буде сприятливим.
Висновок
Молекулярний каріотипування методом аналізу мікрочипів робить революцію в медичній діяльності цитогенетичної діагностики. Хоча ця технологія іноді може надати дані, які важко інтерпретувати, у великій кількості випадків визначаються нові кореляції генотип-фенотип і виникають нові синдроми на основі періодичних геномних змін. Ця технологічна революція та майбутні, що відбудуться найближчим часом, зокрема повна повторна послідовність геному, вимагає нового способу переосмислення діагностичного підходу генетичних захворювань у біологічному та клінічному контексті. Тільки співпраця міждисциплінарних наукових та медичних команд, національних та міжнародних, дозволить краще зрозуміти цю нову область дослідження, яка часом викликає занепокоєння, але така хвилююча.
Практичні наслідки
Показаний аналіз мікрочипів:
> Для вивчення порушень розвитку з нормальним каріотипом, таким чином дозволяючи:
для постановки етіологічного діагнозу приблизно в 15% випадків
визначити ризик рецидивів для сім’ї та, залежно від випадку, встановити аналіз для пренатальної діагностики
для виявлення нових синдромів
> Як частина дитячої онкології як прогностичний маркер для деяких пухлин
Бібліографія
Анотація
Структурні геномні аномалії відіграють ключову роль у патогенезі розладів людини і є однією з перших причин психічних розладів, складних синдромів та пухлин. Для того, щоб виявити ці хромосомні аномалії, було розроблено багато методологій з обмеженнями. Нова порівняльна геномна гібридизація на основі ARRAY (ARRAY CGH) - це революційний підхід, який дозволяє характеризувати дуже малі генетичні аномалії, які неможливо виявити за стандартними підходами та за відсутності будь-якої пов'язаної клінічної інформації. Метою цієї статті є описати, чому застосування нової методології CGH масиву необхідне при етіологічному пошуку генетичних захворювань, які межі є стандартними підходами та до кого аналіз масиву CGH може застосовуватися в педіатричному середовищі. Будуть представлені приклади нашої практики.