ДИПЛОМНА ТЕЗА. Біологічна активність нещодавно синтезованого похідного тіокарбонової кислоти (MAH4 HCl) на ізольованих органах морських свинок

1 ДИПЛОМНА ТЕЗА Біологічна активність нещодавно синтезованого похідного тіокарбонової кислоти (MAH4 HCl) на органах, виділених від морських свинок Автор Özlem Çetinkaya Бажаний науковий ступінь Magistra der Pharmazie (Mag. Pharm.) Відень, 2012 р. Номер дослідження згідно з навчальним листом: Керівник 449 згідно з описом: Ао. Ун-т-проф. Лікар. Крістіан Студеник

2 Для моєї родини та Бернгарда

3 Подяка Перш за все, я хотів би подякувати своїм батькам Фірдесу та Мехмету Четінкаї, моїм братам і сестрам Айлему, Ейлен, Оздену і Мурату, а також моєму нареченому Бернарду, який стояв позаду мене протягом усього курсу. З моїм керівником Ао. Ун-т-проф. Лікар. Я від усієї душі дякую Крістіану Студеніку за цінні імпульси та велику, людську та компетентну підтримку. Я також хотів би подякувати пану Ао. Ун-т-проф. Лікар. Томас Еркер та робоча група Департаменту медичної/фармацевтичної хімії за надання досліджуваної речовини.Я також хотів би висловити щиру подяку своїм друзям Алмі Сейдінович, Міладі Авдіч та Хамді Канану за активну підтримку. З ними навчання в бібліотеці AKH було набагато цікавішим. Ти завжди був зі мною в добрі та погані часи, і ти завжди матимеш чудове місце в моєму серці. Тоді я хотів би подякувати своїм родичам, Масталу, за їх велику підтримку в коректурі тези.

4 Зміст 1 Вступ Гіпертонія серця Сульфід водню Цілі Матеріал та методологія Тестова речовина MAH4 HCl Розчинник Експериментальні тварини Фізіологічний розчин електролітів Органи, що використовуються Підготовчі матеріали Використовується праве передсердя Папілярний м’яз легеневої артерії (Musculus paterialis) Малий кишковик (Ileum Terminal Карбоген Виконання експериментів Вплив речовин на ізольовані органи морської свинки Atrium dexter (праве передсердя) Musculus papilaris (сосочковий м’яз) Кінцева клубова кишка (тонка кишка) Аорта низхідної легеневої артерії (легенева артерія)

3.6.2 Дослідження механізму дії МАГ 4HCL у кишечнику Дослідження з глібенкламідом та нітро-L-аргініном Оцінка даних та статистики Atrium dexter Musculus papiralis Aorta, Arteria pulmonalis, Terminalis ileum Результати статистики Результати досліджуваної речовини MAH 4HCl Atterum cortilus descendens легеневої артерії кінцевої клубової кишки Дослідження механізму дії досліджуваної речовини MAH4 HCl на кишечник Вплив MAH4 HCl у поєднанні з NO-L-аргініном на кишечник Вплив MAH4 HCl у поєднанні з глібенкламідом на кишечник Обговорення Резюме Бібліографія Біографія

15 3 Матеріал та методологія 3.1 Випробовувана речовина Речовина, що підлягає випробуванню, була випробувана на факультеті наук про життя кафедри медичної/фармацевтичної хімії АО. Ун-т. Професор доктор Томас Еркер, щойно синтезований та наданий для випробування МАГ4 HCl Рисунок 1: Хімічна структура МАГ4 HCl MG: 297,89 г/моль октил [2- (диметиламіно) етокси] метантіоат гідрохлорид 10

3.1.2 Розчинник Для проведення експериментів речовину потрібно було попередньо повністю розчинити у відповідному розчиннику. MAH4 HCl дуже швидко і повністю потрапив у дистрибуцію. Розчинний у воді. Початкову масу завжди вибирали таким чином, щоб концентрація 100 мкмоль/л у посудині досягалася в ваннах з органами після повного кумулятивного додавання. Доступні ванни для органів були 8 мл і 25 мл. Розрахунок: MG/4/100 = розрахунок для великого судна MG/12,5/100 = розрахунок для малого судна У таблиці 2 наведені розраховані та використані запаси розчинів: Таблиця 2: Основні розчини Речовина Молярна маса MAH4 HCl 297,89 г/ванна об'ємом моль для органів у початковій масі досліджуваної речовини (100 мкмоль/л)/мл для ванни для органів 80, 74 Вихідні розчини додавали кожні сорок п'ять хвилин за допомогою мікропіпетки Фіна і вимірювали ефект. Додані концентрації наведені в таблиці 3 нижче. Таблиця 3: Відображення схеми піпетування Додана кількість Кінцева концентрація 3 мкл 3 мкмоль/л 7 мкл 10 мкмоль/л 20 мкл 30 мкмоль/л 70 мкл 100 мкмоль/л 11

21 Рисунок 4: Схематичне зображення серця (Netter FH 2003) 16

23 виграли фігуру завдовжки 3 см. Ізоляцію доводилося робити дуже обережно, оскільки це могло травмувати та перерозтягувати аорту. Потім аорту, як і всі інші препарати, поміщали в чашку Петрі з Тайродом і закріплювали на пробковій подушці двома препаруючими голками. Потрібно було переконатись, що він не перенапружений. Навколишню тканину, жир та кров обережно видаляли та розрізали на шматки довжиною приблизно 2 мм. Дефектні та неправильні деталі утилізували. Рисунок 6: Схематичне зображення аорти (Netter FH 2003) 18

24 3.5 Використаний апарат В експериментах було використано два різні апарати. Тести на сосочкові м'язи проводили на апараті 1, а на аортальному, передсердному та кишковому - на апараті 2. Органи були підвішені на силових перетворювачах над срібним дротом. Перетворювач сили перетворив механічну силу в електричний сигнал і передав її на підсилювач, який підсилював електричний сигнал і малював його на міліметровому папері за допомогою пера. Для того, щоб мати можливість порівняти експерименти, потрібно було завжди працювати в однакових умовах з точки зору подачі кисню, температури, значення рН, вироблення та складу тироду. Апарат 1 Апарат 1 використовувався лише для експериментів на сосочкових м’язах. Конструкція: Апарат містить водяну баню з акрилового скла. У цю водяну баню виступає м’язова камера. Також є штатив, до якого прикріплені перетворювач сили, тонкий привід та тримач органу. Для кращого розуміння див. Рисунок 6. 19

25 Рисунок 7: Ескіз апарату 1 М’язова камера містить 25 мл, тому такий самий об’єм використовували для Tyrode. Водяну баню термостатували до постійної температури 35 ° С. Це створило фізіологічні умови. Поживний розчин потрібно було відрегулювати до цього значення, саме тому тироду помістили в камеру за 10 хвилин до експерименту. Препарат був описаний раніше в главі. М'язовий препарат поміщали в контакт із датчиком сили срібним гачком над срібним дротом, сосочковий м'яз був затиснутий між електродом і оргскловим диском. Потім тримач опустили в м’язову камеру так, щоб зразок повністю стояв у Тироді. Папілярні м’язи не б’ються спонтанно, як передсердя, але їх потрібно стимулювати. Це було досягнуто за допомогою стимулятора Accupulser (модель Isostim 301T. WPI, Hamden, CT, USA). Скорочення передавалось на перетворювач сили через хлоридно-провідниковий дріт, посилювалося підсилювачем і передавалось на планшетну ручку. 20-го

26 Рисунок 8: Оригінальне зображення апарату Апарат 2 Апарат 2 (див. Малюнок 8) використовували для тестів на аорті, легеневій артерії, кінцевій клубовій кишці та правому передсерді. Водяну баню довели до 37 ° С. У випадку аорти та легеневої артерії зразки у формі кільця прикріплювались безпосередньо до датчика сили за допомогою срібного дроту. У кишечнику та передсерді два срібні гачки раніше були прикріплені до двох кінців, і вони також були з'єднані з датчиком сили. В апараті 2 тестові предмети опускали у ванни з органами, наповнені тиродом. Для ванн з органами також встановлювали температуру 37 ° С і обробляли газом. Попереднє натягування застосовувалося за допомогою тонкого приводу, потім примусовувалось скорочення, і ці скорочення або їх зміни перетворювались на поточні сигнали та реєструвались. 21-го

27 Рисунок 9: Ескіз апарату 22

28 Рисунок 10: Оригінальна ілюстрація апарату Перетворювач сили За допомогою перетворювача сили механічні зміни перетворюються в електричні за допомогою так званого містка Уітстона, що робить можливим вимірювання. У датчику сили є розтяжки. Коли відбувалися зміни сили скорочення органів, пропорційно змінювались також опір подовженню та потоку струму. Зміни в скороченні та розслабленні м’язів можуть передаватися на планшетний реєстратор (планшетний реєстратор моделі BD 112 від компанії World Precision Instruments (WPI), Сарасота, Флорида, США) через підсилювач (Transbridge TM, 4-канальний підсилювач перетворювача, від World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA) Кіпп і Зонен). Це передає імпульси на міліметровий папір. 23

29 Рисунок 11: Ескіз силового перетворювача Постачання карбогену У всіх експериментах для забезпечення достатнього надходження кисню, рівномірної суміші активної речовини та збереження величини рН стало необхідним постійне забезпечення органів газом карбогену. Це стало можливим за допомогою шлангової системи, яка була з'єднана з кожною ванною органу. Скляні фритюри знаходились прямо перед входом до лазні. Вони забезпечили тонке розпилення і, разом із затискачами на початку шлангів, оптимальну дозу повітря. Малюнок 12: Оригінальне зображення подачі газу 24

33 KCl взяли і розчинили в 100 мл тироду. Тут також відбувається швидке скорочення, яке так само швидко знову зменшилося. Почекали близько 45 хвилин, поки не сформується стабільна фаза плато. Речовину додавали знову за відомою схемою легеневої артерії (легеневої артерії). Хід експерименту був таким же, як і для аорти, різниця була лише в напрузі, яка завжди була постійною при 5 мВ, тобто 9,81 мн, - це дослідження механізму дії MAH 4HCL на кишечник Дослідження з глібенкламідом та нітро-L-аргініном Кишечник був підготовлений, як описано в розділі, і прикріплений до апарату 2. Про хід експерименту дивіться в главі. Тут ви чекали, поки не настане фаза постійного плато, потім були додані антагоністи глібенкламід або нітро-L-аргінін, остаточна концентрація в ванні для органів становила 100 мкмоль/л. Через 45 хвилин додавали 15 мкл основного розчину і давали діяти ще 45 хвилин, після чого експеримент закінчували. Глібенкламід Рисунок 13: Глібенкламід (MW = 494,0 г/моль) 28

36 нульовий рядок. Таким чином ви могли б пропорційно порівнювати значення. Для цього потрібно було взяти до уваги коефіцієнт калібрування, який відповідав 5 мВ на 1 см або 0,98 млн. Якщо ви працювали при 2 мВ, значення потрібно було помножити на 0,2, а при 10 мВ - на 2 статистичні дані. Для статистичної оцінки сили стиснення та частоти ударів були розраховані середні значення та стандартна похибка середніх значень (SEM). Для обчислення цих статистичних значень та EC50 використовувалася програма Sigma Plot 9.0. Ця програма пояснює середню ефективну концентрацію активного інгредієнта в ммоль/л, при якій досягається половина контрольного значення. Для того, щоб спостерігати ймовірність помилки, було проведено t-тест Стьюдента для парних спостережень. Значення менше 0,1% (P 0,001) були дуже значущими, а значення 5% (P 0,05), 1% (P 0,01) були значущими. Значення з імовірністю помилки> 5% (P> 0,05) не були значущими значеннями. 31

38 Таблиця 5: Результати випробувань MAH 4HCl у правому передсерді MAH4HCL f ± SEM f ± SEM (мкмоль/л) (х/хв) (%) Кількість ймовірностей спроб помилок (P) n контроль 180 ± 8,66 0 ±, 50 ± 8,54 1,52 ± 2,60 4 нс, 50 ± 12,50-1,18 ± 5,08 4 нс ± 9,24-15,27 ± 3,87 4 0, ± ± 0 4 0,001 У таблиці 5 наведено середні арифметичні значення (f) у ударах/хв та у відсотках, а також їх стандартні похибки (SEM) для відповідної концентрації. n - кількість спроб. 33

39 Діаграма 1: Крива ефекту концентрації MAH4 HCl у правому передсерді AURRO n = 4 MAH 4 HCL EC 50 = 49 мкмоль/л 25 Зниження частоти ударів (%) Концентрація (Μмоль/л) На цій діаграмі показано зміну частоти ударів як функцію кількість речовини в органній камері. Частоту удару вводили у% по осі y та концентрацію досліджуваної речовини по осі x. Значення EC 50 було показано штриховими лініями і становить 49 мкмоль/л. Крапки показують розраховані середні значення частоти ударів при відповідних концентраціях, а стовпчики показують їх стандартні похибки. 34

40 Рисунок 15: Оригінальний запис хронотропного ефекту MAH4 HCl 12 сек 1 см = 0,98 мн. Негативний хронотропний ефект можна прочитати з кількості ударів. 35

4.1.2 Musculus papilaris Для оцінки інотропного впливу на сосочковий м’яз було проведено чотири експерименти. Контрольне значення становило 1,58 ± 0,45 млн. Додавання речовини призвело до зменшення сили скорочення. При концентрації 3 мкмоль/л це зниження становило -15,05 ± 8,34% і ставало все більшим і більшим. При кінцевій концентрації 100 мкмоль/л сила стиснення становила 0,08 ± 0,02 мН або 94,92 ± 1,58% від контрольної величини. Таблиця 6: Вплив MAH 4HCl на папілярний м'яз MAH4HCL fc ± SEM fc ± SEM (мкмоль/л) (mn) (%) Кількість ймовірностей спроб помилок (P) n контроль 1,58 ± 0,45 0 ±, 23 ± 0, 43-15,05 ± 8,34 4 0,99 ± 0,36-40,46 ± 5,70 4 0,57 ± 0,19-65,92 ± 3,05 4 0,08 ± 0,02-94,92 ± 1,58 4 0,001 У цій таблиці наведено середні арифметичні значення (fc) та їх стандартне відхилення (SEM) при концентрації, присутній як у mn, так і у відсотках. 36

42 Діаграма 2: Крива ефекту концентрації МАГ4 HCl на папілярному м’язі 0 МАШИНА ПАПІЛЯРА МАХ 4 HCl n = 4 EC 50 = 15 мкмоль/л зменшення сили скорочення (%) конц. (Μмоль/л) кількість речовини в органній камері. Зменшення сили скорочення в% вводили на вісь y, а концентрацію досліджуваної речовини в мкмоль/л на вісь x. Значення EC 50 було показано штриховими лініями і становить 15 мкмоль/л. Крапки показують розрахункові середні значення сили стиснення при відповідних концентраціях, а стовпчики показують їх стандартні похибки. 37

43 Рисунок 16: Оригінальний запис інотропного ефекту MAH4 HCl 1 см = 0,98 мн. Зниження сили стиснення можна чітко помітити на довжині амплітуди. Довжина амплітуди зменшується із збільшенням концентрації досліджуваної речовини в органній камері, що базується на негативному інотропному ефекті досліджуваної речовини. 38