Дисертація. для отримання вченого ступеня. Лікар. мед. на медичному факультеті. університету в Лейпцигу
1 Тканинна інженерія тривимірної серцевої тканини з використанням мезенхімальних стовбурових клітин та гістологічне дослідження тканини на інтеграцію та диференціацію клітин у моделі in vivo на щурах Дисертація на здобуття наукового ступеня Dr. мед. на медичному факультеті Лейпцизького університету Представлено: Cathleen Spath Дата та місце народження:, Bad Frankenhausen Завершено: Центр серця Лейпциг Керівник: Проф. мед. Постанова Стефана Дейна про присудження докторського ступеня від:
2 Зміст Бібліографічний опис Список скорочень v vi 1 Вступ Передумови Альтернативні типи клітин для інженерії серцевої тканини Характеристика МСК Пластичність МСК Використання МСК у серцевій регенеративній медицині Подвійна роль МСК у розвитку пухлини Питання та цілі Матеріали Прилади та допоміжні засоби Лабораторне начиння Хімічні та біохімічні препарати Хімічні речовини для експериментів на тваринах Лабораторні тварини Клітини Інформація про виробника: cmscs Хімічні речовини для гістології Первинні антитіла Вторинні антитіла Мічені антитіла для FACS Склад середовища Загальні розчини Розчини для гістології Методи Використовувані лінії MSC Виділення мезенхімальних стовбурових клітин з дорослого кісткового мозку щурів (smsc) Анестезія щурів Розморожування та культивування cmscs Субкультура двох ліній MSC Характеристика MSCs Поточні цитометричні вимірювання MSCs Підготовка зразків Вимірювання зразків на проточному цитометрі ii
4 Зміст 5 Обговорення 71 6 Короткий зміст 80 Список рисунків 82 Список таблиць 84 Бібліографія 85 Додатки 99 Декларація незалежності 102 Автобіография 103 Публікації 104 Подяки 106 iv
6 Список скорочень AEC AK Aqua dest. BSA BMC BM-MSC BMMNCs CaCl 2 2 H 2 O CEE CD CH 2 O cmsc cmsc-et CSC 3-Amino-9-Ethylcarbazole Антитіла Дистильована вода Бичачий сироватковий альбумін клітини кісткового мозку (нефракціоновані клітини кісткового мозку) мезенхімальні стовбурові клітини, отримані з мононуклеару кісткового мозку клітини (мононуклеарні клітини кісткового мозку) хлорид кальцію дигідрат курячого ембріона екстракт кластера диференціації формальдегід комерційно придбані мезенхімальні стовбурові клітини з кісткового мозку щура Інженерна тканина з серцевих стовбурових клітин cxc Cx40 Connexin 40 Cx43 Connexin 43 Cx45 Connexin 45 DAPI DMSO EDTA EGFF FKS FSC GJIC HCl HE 4,6-діаміно-2-феніліндол диметилсульфоксид етилендіамін тетраацетат ендотеліальний фактор росту Інженерна тканина серця Позаклітинна матриця флуоресценція активоване сканування клітин (проточний цитометр) Флуоресцеїн ізотіоціанат фібробласт фактор росту мембрана кісткова кісткова кислота медіатрансфераза мембрана зворотне диспергування метеорологія -Еозин vi
7 Список абревіатур IPS-клітини, індуковані плюрипотентними стовбуровими клітинами Поле високої потужності HPF (1 HPF = 0,1734 мм 2) HS IgG KCl Kg KG KH 2 PO 4 кінська сироватка Імуноглобулін G Хлорид калію Кілограм маса тіла Калію дигідрогенфосфат Klf4 Kruppel-подібний фактор 4 MgCl 2 6 H 2 O MSC MSC-ET NaCl NaH 2 PO 4 2 H 2 O NaOH Na 2 HPO 4 2 H 2 O Хлорид магнію гексагідрат мезенхімальні стовбурові клітини Розроблена тканина з мезенхімальних стовбурових клітин Натрію хлорид Натрію дигідроген фосфат Натрію гідроксид Динатрію гідроген фосфат Окт4 октамер зв'язуючий фактор транскрипції 4 P/S PBS RT Sms sms RT Pms et penicillin/streptomycin phosphate забуференний фізіологічним розчином кімнатної температури стандартна похибка середньої самоізольованої мезенхімальної стовбурової клітини з кісткового мозку щура Engineered Tissue from smsc Sox-2 sex definition region Y (SRY) -box 2 SSC TBS TGFβ TRIS TRITC rpm VEGF vwf side розсіяний трис-буферний сольовий розчин, що трансформує фактор росту бета-трис (гідроксиметил) -амінометан тетраметил-родамін ізо-тіоціанат U оборотів в хвилину фактор росту ендотелію судин фон фактора Віллебранда vii
16 2 Матеріали 2.1 Пристрої та допоміжні засоби Пристрої/допоміжні засоби Тип Виробник Країна/Місто Всмоктувальний пристрій Клітинна культура/мікробіологія NeoLab Heidelberg DE/Heidelberg Автоклав Varioklav 75T HP Medizintechnik GmbH DE/Oberschleißheim Рушник для живота см NOBA Verbandmittel Danz GmbH & Co. KG Ventilator ADS 1000 Engler Engineering Верхній фільтрувальний інкубатор Хірургічні одноразові скальпелі Nalgene FastCap Фільтр-флакон типу BB 16 & 16CU Sigma Aldrich und Chemie GmbH Heraeus Instruments GmbH DE/Wetter US/Hialeah DE/Steinheim DE/Gera BB513, BB511 Aesculap DE/Tuttlingen Pressre Products NO 367 HSE Машина для вбудовування Егерсунда Одноразова хірургічна драпіровка Тканина Tek Vip E150/E см Ранкодроп Sakura Finetek Europe BV Lohmann & Rauscher GmbH & Co. KG NL/Alphen aan den Rijn DE/Neuwied Одноразові бритви Med Compfort AMPri GmbH DE/Stelle Eismaschine 2BE Ziegra-Eismaschinen DE/Isernhagen Електростимуляційний проточний цитометр (FACS), вироблений власною медичною технологією/Центр серця Лейпциг Лейпциг II BD DE/Гейдельберг Faden шовкові плетені SMI BE/St. Vith Waage Microbalance Sartorius BP210D DE/Göttingen Camera PowerShot G5 Canon GB/Middlesex Gasflowmeter M-45 Stöckert Instrumente DE/Munich 9
19 2 Матеріали Пристрої/допоміжні засоби Виробник Країна/Місто Теплова ванна гістологія Тип 24900 Medax Nagel GmbH DE/Кільська теплова шафа M400 Memmert GmbH & Co. KG DE/Schwabach Q-Gard2 EMD Millipore Corporation США/Billerica Банк клітинної культури Тип HS12 Heraeus Instruments GmbH DE/Gera Центрифуга Megafuge 1.0 R Heraeus Instruments GmbH DE/Gera Таблиця 2.1: Пристрої та ресурси. 2.2 Лабораторний посуд Лабораторний посуд Тип Виробник Країна/Місто Стрічка для автоклавування Steri Clin VP-Group DE/Feuchtwangen Покривні склянки мм, мм Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe EHT форма саморобна Glasbläserei Kind DE/Leipzig Вбудована форма Тканина Tek III Sakura Finetek Europe B.V. Касети для вкладання K115.1 Carl Roth GmbH & Co. KG Еппендорфські туби 0,5 мл, 1,5 мл, 2,0 мл Greiner-Bio-One GmbH NL/Alphen aan den Rijn DE/Karlsruhe DE/Frickenhausen Erlenmeyer flask 2 l Simax US/Система водопідготовки Elk Grove Village FACS - трубки з круглим дном/BD DE/Heidelberg FACS Flow 20 л, BD DE/Heidelberg Falcontubes 15 мл, 50 мл Greiner Bio-One GmbH DE/Frickenhausen Fettstick Dako Pen Dako GmbH DE/Hamburg Humidity Chamber Wolfgang Weckert Labortechnik DE/Кітцінгенський фільтр 100 мкм 2 BD DE/Гейдельберг фільтрувальний папір скляні пляшки Тканина Tek II SA мл, 500 мл, 1000 мл Vogel GmbH & Co. KG Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Gießen DE/Karlsruhe 12
21 2 Матеріали Лабораторне начиння Тип Виробник Країна/Місто Серологічні наконечники піпеток Шприци Ваги 2 мл, 5 мл, 10 мл, 25 мл 2 мл, 5 мл, 100 мл, 25 мл мм, мм ТЕС TP BD Carl Roth GmbH & Co. KG Флакони для культури клітин 75 см 2 Greiner Bio-One GmbH США/вул. Луїс DE/Гейдельберг DE/Карлсруе DE/Фрікенхаузен Таблиця 2.2: Лабораторний посуд. 2.3 Хімічні та біохімічні речовини Загальні хімічні речовини Тип Виробник Країна/місто Денатурований етанол, 99,8% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe HCl 37% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe Isopropanol Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Карлсруе KCl Merck KGaA DE/Дармштадт NaCl> 99,5% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Карлсруе NaOH> 99% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Карлсруе метанол> 99% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe TRIS> 99% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe Таблиця 2.3: Загальні хімічні речовини. Хімікати для культури клітин Тип Виробник Країна/Місто Аква дест. BSA Глюкоза моногідрат D + Milli Q Академічна система Millipore GmbH Sigma Aldrich und Chemie GmbH DE/Schwalbach DE/Steinheim для мікробіології Merck KGaA DE/Дармштадт CaCl 2 2 H 2 O Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe 14
22 2 Матеріали Хімікати для культури клітин Тип Виробник Країна/Місто HEPES> 99,5% Sigma Aldrich und Chemie GmbH DE/Steinheim KH 2 PO 4> 99,5% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe MgCl 2 6 H 2 O Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe Na 2 HPO 4 2 H 2 O Merck KGaA DE/Дармштадт NaH 2 PO 4 2 H 2 O Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe силіконовий клей Dow Corning 734 Dow Corning Corporation US/Midland Силіконовий клей стерильний Medtronic World США/Міннеаполіс Trypan Blue 0,4% Life Technologies GmbH/Gibco DE/Дармштадт Таблиця 2.4: Хімічні речовини для культури клітин. Культуральні середовища та компоненти EHT Тип Виробник Країна/Місто Набір для диференціації адипогенезу Курячий зародок Екстракт Матригель (позаклітинна матриця) Фетальна теляча сироватка (FCS) A Thermo Fisher Scientific DE/Дармштадт Заморожений CE-650-J Sera Laboratories International BD, Merck KGaA/Biochrom GB/Cuckfield DE/Heidelberg DE/Berlin Horse Serum Thermo Fisher Scientific DE/Дармштадт Коллаген Тип I щурячий хвіст Sigma Aldrich und Chemie GmbH DE/Steinheim Kollagenase Type II Merck KGaA/Biochrom DE/Берлін M199 1-разовий Thermo Fisher Scientific DE/Дармштадт M199 2-разовий Thermo Fisher Scientific DE/Дармштадтський пеніцилін/стрептоміцин 5000 МО/мл пеніциліну, 5000 мкг/мл стрептоміцину Thermo Fisher Scientific DE/Дармштадт Таблиця 2.5: Поживні середовища та компоненти ЕГТ. 15-й