Дослідження розподілу імунних клітин у периферичній крові при ожирінні, спричиненому дієтою
1 Від Інституту анатомії та клітинної біології медичного факультету Університету Мартіна Лютера Галле-Віттенберг Директор: проф. мед. Хейке Кілштейн Дослідження розподілу імунних клітин у периферичній крові в індукованій дієтою моделі ожиріння щурів після індукції пухлини Дисертація на здобуття вченого ступеня доктора медицини (доктор медичних наук) Представлена на медичному факультеті Університету Мартіна Лютера Галле-Віттенберг Дорле Кнауф народився у Фрайберзі (Саксонія) Рецензент: 1. Проф. мед. Хайке Кілштейн 2-й PD д-р мед. Ганс-Юрген Сейфарт (Лейпциг) 3. Проф. мед. Торальф Ланге (Вайсенфес)
5 показали метастази в легенях у ожирілих тварин. Ці спочатку виявляються чисельні обмеження NK-клітин і моноцитів можуть також бути причиною того, що розселення клітин MADB106 у легенях і, отже, формування метастазів у легенях у ожирілих тварин в першу чергу можливе і прогресує швидше.
7 Зміст I Зміст Сторінка 1. Вступ Ожиріння Жирова тканина Вплив адипокінів на імунні клітини Ожиріння асоційовані пухлинні захворювання Мета Матеріал та методи Випробування тварин та тваринництва Експериментальна установка Модель пухлини Ін’єкція клітин MADB106 або NaCl Отримання та аналіз матеріалу зразка Видалення крові та органів Визначення ліпідів та визначення концентрації Імунологічні тести Виділення PBMC та лізис еритроцитів за Швінцером Визначення числа PBMC за допомогою лічильної камери Нойбауера Фарбування специфічних імунних клітин з використанням флуорохром-пов'язаних антитіл Поточні цитометричні вимірювання з використанням оцінки FACS FACS Кількісне визначення NK-клітин, клітин пухлинних клітин та клітин NK-клітин або поверхневих метастазів у поверхневих метастазах Легенева тканина Визначення відносних концентрацій мрна в тканині селезінки у щурів нормальної ваги або ожиріння F344 за допомогою статистики ПЛР у реальному часі 26
8 Зміст II 3. Результати Розвиток ваги досліджуваних тварин Короткочасний експеримент Тривалий експеримент Концентрація тригліцеридів і холестерину в печінці Сортировщик активованих клітин Fluorezens (FACS) - вимірювання в короткостроковому експерименті NK-клітини B-лімфоцити T-лімфоцити Цитотоксичні (CD8 +) T -Клітини Т-хелперні клітини (CD4 +) моноцити Флуорезенс активований сортувальник клітин (FACS) - вимірювання в довгостроковому експерименті NK-клітини B-лімфоцити T-лімфоцити Цитотоксичні (CD8 +) T-клітини T-хелперні клітини (CD4 +) моноцити кількісна оцінка NK-клітини MADB106-клітини та взаємодія NK-клітин-пухлинних клітин, а також поверхневі метастази в легенях Відносна концентрація мрна, що активує та інгібує рецептори NK-клітин, та NK-клітин-специфічні цитокіни в тканині селезінки Відносні концентрації мрна в короткостроковому експерименті Відносна мрна Концентрації в тривалому експерименті Підсумок обговорення Бібліографія 58
9 Зміст III 7. Тези 68 Декларація про незалежність Декларація про попередні докторські спроби Табличне резюме Подяка
10 Список скорочень IV Список скорочень ANOVA APC BMI CD CFSE CRP DIO FACS FITC IFNγ IL i.v. JAK-STAT KIR MALT MCP-1 MHC MP-NK клітини mrna Ms IgM/G NaCl NKG2D NK клітини PBS PBMC PCR PE Аналіз дисперсії Аллофікоціанін Індекс маси тіла Кластер диференціації Карбоксифлуоресцеїн сукцинімідиловий ефір С-реактивний білок Індукована дієта Флуоресценція Активоване сортування клітин Флуоресцеїн Ізотіоціанат Інтерферон Гамма Інтерлейкін внутрішньовенно Янускіназа - Перетворювачі сигналу та активатори транскрипції Іммуноглобуліноподібні рецептори Кіллери, що вбивають клітини Слизова оболонка, Лімфоїдна тканина, Моноцити, Хемотаксичний Білок-1, Основний, Гістологічно-Імунологічний Комплекс, Марго-Імуномодулюючий Комплекс, Марго-Імуномодулюючий Комплекс, Група вбивць 2, член D Натуральні клітини-вбивці Фосфатно-сольовий розчин, насичений сольовим розчином периферичної крові, мононуклеарна клітинна полімераза, ланцюгова реакція Фікоерітрин
11 Список скорочень V PE-Cy7 Phycoerithrin-Cyanin 7 PPARγ RPMI Medium SEM Peroxysome Proliferator Activate Receptor-Gamma Roswell Park Memorial Institute Medium Стандартна похибка середнього значення T H1/2 T допоміжних клітин 1/2 T Reg TNFα WHO T регулятор клітин пухлини -Фактор некрозу Альфа Всесвітньої організації охорони здоров'я
32 Інтерпретація матеріалу та методів 21. Нарешті, визначені властивості клітин були представлені у вигляді гістограми або крапкової діаграми. Таким чином, більш ніж десять тисяч клітин можуть бути віднесені до певної популяції або субпопуляції менш ніж за хвилину. Рис. 5: Схематичне зображення методу проточної цитометрії. За допомогою спеціальних лінз клітини аналізують, використовуючи розсіяне світло вперед (FSC розсіяний вперед) і розсіяне побічне світло (SSC бічний розсіювач). Дзеркала використовувались для вирівнювання світлових сигналів, щоб їх в кінцевому підсумку можна було підхопити детекторами і перетворити на сигнали електричної напруги Оцінка FACS За допомогою проточних цитометричних вимірювань B і T-клітини, NK-клітини та моноцити досліджували по-різному (рис. 6, 7). 6: Проаналізовані популяції В, Т-клітин та моноцити Рис. 7: Проаналізовані популяції NK-клітин
34 Матеріал та методи 23 цитотоксичні Т-клітини Рисунок 10: Репрезентативний точковий графік фарбування цитотоксичних Т-клітин або Т-хелперних клітин; цитотоксичні Т-клітини (CD8a PE +, CD4 PE-Cy7 -) у верхньому лівому квадранті; Т-допоміжні клітини (CD8a PE -, CD4 PE-Cy7 +) у правому нижньому квадранті. Фігура 11: Репрезентативна точкова ділянка фарбування моноцитів; Моноцити (CD4 PE-Cy7 +, CD3 APC -) NK-клітини, а не NK-клітини Рисунок 12: Репрезентативний точковий графік фарбування NK-клітин; NK-клітини [CD161a яскраві (CD161a PE +, CD3 APC -)] у верхньому лівому квадранті, не-nk-клітини [CD161a тьмяні (CD161a PE +, CD3 APC -)] у нижньому лівому квадранті. Рисунок 13: Затвор PE CD161a, мінімуми 10 4.1 для NK-клітин (CD3 -/CD161a яскравий) та 10 2.2 для не-nk-клітин (CD3 -/CD161a затемнений)
37 Статистика матеріалів та методів Статистична оцінка проводилась із використанням програмного забезпечення GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, USA). Дані оцінювали за допомогою однобічного дисперсійного аналізу (ANOVA) та подальшого тесту багаторазового порівняння Тукі. Для того, щоб можна було визначити загальні ефекти дієти та пухлинних клітин незалежно від іншого фактора, було проведено двосторонній тест ANOVA з подальшим тестом Бонферроні. Межа значущості для обох тестів базувалася на ймовірності помилки не більше 5% (Р 0,05).
38 Результати Результати 3.1 Розвиток ваги піддослідних тварин Короткотермінове випробування Середня маса тіла випробуваних тварин на початку випробування становила 183,54 г у контрольній групі та 183,76 г у групі DIO. Щури, які отримували нормокалорійну контрольну дієту протягом шести тижнів, збільшили середню масу на 58% до 290 ± 2,6 г за цей час. Навпаки, тварини, які отримували висококалорійну дієту DIO, збільшили свою масу тіла на 65,5% до середнього значення 304 ± 3,9 г (таблиця 3). Таким чином, на момент ін’єкції пухлинних клітин або носія NaCl тварини, що годувались DIO, досягли значно вищої маси тіла порівняно з тваринами, які отримували контрольну дієту (Р = 0,006) (рис. 16). Таблиця 3: Розвиток ваги контрольних щурів та щурів DIO протягом короткотермінових експериментальних тижнів після початку дієти Розвиток ваги 183,54 ± 1,5 212,37 ± 1,6 238,13 ± 2,3 255,2 ± 2,34 268, 34 ± 2,4 284,16 ± 2,75 290,24 ± 2,62 контроль [г] розвиток ваги DIO [г] 183,76 ± 1,6 227,18 ± 1,79 251,02 ± 2,61 271 .05 ± 2,79 283,24 ± 3,46 297,47 ± 3,8 304,11 ± 3,88 Наведені середні значення та відповідна стандартна похибка (± SEM); n = 8 щурів/група
40 Результати 29 Таблиця 4: Розвиток ваги контрольних щурів та щурів DIO протягом тривалих експериментальних тижнів після початку дієти Контроль розвитку ваги [р] 195,53 ± 1,81 222,59 ± 2,17 245,93 ± 2,46 259, 45 ± 2,81 271,8 ± 2,88 284,29 ± 3,08 294,75 ± 3,02 Розробка ваги DIO [г] 195,53 ± 2,07 227,28 ± 2,47 253,74 ± 3, 33 269,09 ± 3,68 277,51 ± 4,51 294,16 ± 4,14 304,78 ± 4,43 тижні після початку дієти Контроль надбавки ваги [г] 302,76 ± 3,48 310,51 ± 3, 68 318,04 ± 3,66 329,58 ± 4,09 328,73 ± 4,38 332,49 ± 4,75 332,9 ± 5,47 Розвиток ваги DIO [г] 312,69 ± 4,98 327, 54 ± 5,90 336,25 ± 6,66 351,76 ± 7,21 352,66 ± 7,34 355,67 ± 7,31 367,84 ± 9,19 Наведені середні значення ± SEM; n = 8 щурів/група. Пунктирна лінія при переході з 10-го на 11-й тиждень після початку експерименту ілюструє момент часу ін'єкції клітин MADB106 або NaCl.
41 Результати 30 Вага тіла в г * * * * * * * Контроль ДІО внутрішньовенно через тиждень після початку дієти Рис. 17: Розвиток ваги після 13 тижнів годування контрольною дієтою та дієтою ДІО. Наведені середні значення ваги всіх досліджуваних тварин (n = 8), ± SEM. Внутрішньовенне введення клітин пухлини або носія (NaCl) відбулося через 10 тижнів. Часи, коли ваги групи DIO суттєво відрізняються від ваг контрольної групи, позначені *. 3.2 Концентрація тригліцеридів та холестерину в печінці Концентрація тригліцеридів та холестерину в печінці також була значно вищою у щурів DIO порівняно з контрольними тваринами (табл. 5). Таблиця 5: Маса тіла, концентрація тригліцеридів та холестерину в печінці у контрольних та ДІО тварин у короткострокових та довгострокових експериментах Короткотерміновий експеримент Довготривалий експеримент Ін'єкція MADB106 Ін'єкція MADB106 через 21 день після ін'єкції MADB106 TG у печінку (мкмоль/g) Контроль 38 ± 8 38 ± 4 DIO 90 ± 15 * 65 ± 9 * Холестерин у печінці (мкмоль/г) Контроль 6,7 ± ± 0,3 DIO 11,0 ± 1,6 * 9,3 ± 0,8 * показано є середні значення ± SEM; n = 8 щурів/група; значущі значення, позначені *, Р 0,05; TG = тригліцериди
42 Результати FACS - вимірювання в короткостроковому експерименті NK-клітин Оцінка кількості NK-клітин після короткочасного впливу пухлини протягом 15 хвилин показала значні відмінності між контрольними та DIO тваринами. У щурів, що годувались DIO, було значно менше NK-клітин, ніж у контрольних тварин (показано як% PBMC), ніж у контрольних тварин (4,3 ± 0,07 проти 3,95 ± 0,38 (SEM)% PBMC, рис. 18). NK-клітини (% PBMC) KoNaCl KoMADB106 * DIONaCl DIOMADB106 Рисунок 18: Кількісна оцінка кількості NK-клітин у самців щурів F344, які годувались ожирінням, обумовленим дієтою (DIO), або контрольною дієтою (Ko) і через 15 хв після MADB106- Ін'єкція пухлинних клітин (MADB106) або NaCl (n = 8); показані середні значення ± SEM; суттєві відмінності між контрольною та DIO-групами були позначені як *, Р 0,05; PBMC = мононуклеар периферичної крові.
43 Результати В-лімфоцити Після короткої стимуляції клітин пухлини протягом 15 хвилин порівняння кількості клітин В-лімфоцитів не виявило значущих відмінностей між окремими групами (рис. 19). B-лімфоцити (% PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Рисунок 19: Кількісна оцінка B-лімфоцитів у самців щурів F344, які харчуються ожирінням, обумовленим дієтою (DIO), або контрольною дієтою (Ko) і через 15 хв після пухлинних клітин MADB106 -Ін'єкція (MADB106) або NaCl (n = 8); показані середні значення ± SEM; PBMC = Т-лімфоцити мононуклеарних клітин периферичної крові Після короткої стимуляції клітин пухлини протягом 15 хвилин порівняння кількості клітин Т-лімфоцитів не виявило суттєвих відмінностей між окремими групами (Фіг. 20). Т-лімфоцити (% PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Рисунок 20: Кількісна оцінка Т-лімфоцитів у самців щурів F344, які харчуються ожирінням, обумовленим дієтою (DIO), або контрольною дієтою (Ko) і через 15 хв після пухлинних клітин MADB106 -Ін'єкція (MADB106) або NaCl (n = 8); показані середні значення ± SEM; PBMC = Мононуклеар периферичної крові.
44 Результати Цитотоксичні (CD8 +) Т-клітини Після короткої стимуляції пухлинних клітин протягом 15 хвилин не спостерігалося значних відмінностей у кількості цитотоксичних (CD8 +) Т-клітин між окремими групами (рис. 21). 45 Цитотоксичні Т-клітини (% Т-лімфоцитів) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Рисунок 21: Кількісна оцінка цитотоксичних Т-клітин (CD8 +) у самців щурів F344, які отримували ожиріння, спричинене дієтою (DIO), або контрольну дієту (Ko ) і через 15 хв після ін'єкції пухлинних клітин MADB106 (MADB106) або NaCl (n = 8); показані середні значення ± SEM; PBMC = Т-хелперські клітини мононуклеарних клітин периферичної крові (CD4 +) Не було значущих відмінностей між окремими групами при порівнянні кількості Т-хелперних клітин (CD4 + Т-лімфоцити) після короткої стимуляції клітин пухлини протягом 15 хвилин (рис. 22 ). 75 Т-хелперних клітин (% Т-лімфоцитів) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Рисунок 22: Кількісна оцінка Т-хелперних клітин (CD4 +) у самців щурів F344, які харчуються ожирінням, обумовленим дієтою (DIO), або контрольною дієтою (Ko) і через 15 хв після ін'єкції пухлинних клітин MADB106 (MADB106) або NaCl (n = 8); показані середні значення ± SEM; PBMC = мононуклеар периферичної крові.
45 Результати Моноцити Існували суттєві відмінності при порівнянні кількості клітин моноцитів у контрольних тварин із нормальною вагою та ожирінням, яким вводили NaCl. Контрольні тварини з нормальною вагою мали значно більшу кількість моноцитів на основі РВМС у периферичній крові порівняно з контрольними тваринами з ожирінням. Порівняння пухлинних тварин із нормальною вагою та ожирінням, а також порівняння DIO та контрольних груп не виявило істотних відмінностей (рис. 23). Моноцити (% PBMC) KoNaCl * DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Рисунок 23: Кількісна оцінка моноцитів у самців щурів F344, які харчуються ожирінням, обумовленим дієтою (DIO), або контрольною дієтою (Ko) і через 15 хв після ін'єкції пухлинних клітин MADB106 ( MADB106) або NaCl (n = 8); показані середні значення ± SEM; суттєві відмінності між групами, позначеними *, Р 0,05; PBMC = мононуклеар периферичної крові.
46 Результати FACS - вимірювань у довгостроковому експерименті NK-клітин При порівнянні відсотка NK-клітин у PBMC через три тижні після ін’єкції MADB106, між окремими групами не було суттєвих відмінностей (рис. 24). 4 NK-клітини% PBMCs KoNaCl KoMADB106 DIONaCl DIOMADB106 Рисунок 24: Кількісна оцінка кількості NK-клітин у самців щурів F344, які годувались ожирінням, обумовленим дієтою (DIO), або контрольною дієтою (Ko) і через три тижні після кількості клітин пухлини MADB106 Ін'єкція (MADB106) або NaCl (n = 8); показані середні значення ± SEM; PBMC = мононуклеарні В-лімфоцити периферичної крові Навіть через три тижні після ін’єкції клітин MADB106 оцінка кількості клітин В-лімфоцитів не виявила жодних суттєвих відмінностей між окремими групами (рис. 25). B-лімфоцити (% PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Рисунок 25: Кількісна оцінка B-лімфоцитів у самців щурів F344, які харчуються ожирінням, обумовленим дієтою (DIO), або контрольною дієтою (Ko) і через три тижні після пухлинних клітин MADB106 -Ін'єкція (MADB106) або NaCl (n = 8); показані середні значення ± SEM; PBMC = мононуклеар периферичної крові.
47 Результати Т-лімфоцитів Через три тижні після ін’єкції пухлинних клітин між окремими групами не було значущих відмінностей щодо відсотка Т-лімфоцитів у РВМС (рис. 26). Т-лімфоцити (% PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Рисунок 26: Кількісна оцінка Т-лімфоцитів у самців щурів F344, які харчуються ожирінням, обумовленим дієтою (DIO), або контрольною дієтою (Ko) і через три тижні після пухлинних клітин MADB106 -Ін'єкція (MADB106) або NaCl (n = 8); показані середні значення ± SEM; PBMC = Цитотоксичні (CD8 +) Т-клітини одноядерних клітин периферичної крові Оцінка кількості клітин цитотоксичних (CD8 +) Т-клітин після 3 тижнів росту пухлини не виявила суттєвих відмінностей між окремими групами (рис. 27). 45 Цитотоксичні Т-клітини (% Т-лімфоцитів) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Рисунок 27: Кількісна оцінка цитотоксичних Т-клітин (CD8 +) у самців щурів F344, які отримували ожиріння, спричинене дієтою (DIO), або контрольну дієту (Ko ) і через три тижні після ін'єкції клітин пухлини MADB106 (MADB106) або NaCl (n = 8); показані середні значення ± SEM; PBMC = мононуклеар периферичної крові.
48 Результати Т-хелперні клітини (CD4 +) Порівняння кількості клітин Т-хелперних клітин (CD4 +) через 3 тижні росту пухлини не виявило жодних суттєвих відмінностей між окремими групами (рис. 28). 70 Т-хелперних клітин (% Т-лімфоцитів) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Рисунок 28: Кількісна оцінка Т-хелперних клітин (CD4 +) у самців щурів F344, які харчуються ожирінням, спричиненим дієтою (DIO), або контрольною дієтою (Ko) і через три тижні після ін'єкції пухлинних клітин MADB106 (MADB106) або NaCl (n = 8); показані середні значення ± SEM; PBMC = Мононуклеарні моноцити периферичної крові Через 3 тижні росту пухлини порівняння кількості моноцитів не виявило значущих відмінностей між окремими групами (рис. 29). Моноцити (% PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Рисунок 29: Кількісна оцінка моноцитів у самців щурів F344, які харчуються ожирінням, обумовленим дієтою (DIO), або контрольною дієтою (Ko) і через три тижні після ін'єкції клітин пухлини MADB106 (MADB106 ) або NaCl (n = 8); показані середні значення ± SEM; PBMC = мононуклеар периферичної крові.