ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ТВАРИН ДЛЯ ІНФОРМАЦІЇ ФІРМАКОНОВОГО НАБОРУ
1 Клініка та поліклініка загальної, грудної, судинної та трансплантаційної хірургії Ростоцького медичного університету ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ТЕСТУВАННЯ В РІЗНІХ ВИПРОБАВАННЯ ФАРМАКОНОВИХ БІОГРАДУВАЛЬНИХ ПОЛІЛАКТИДНИХ СТАНЦІЙ Інавгураційна дисертація на здобуття вченого ступеня в Університеті Ростока, народжена доктор Христина Ростока у Краснодарі. Росток, 2007 урна: nbn: de: gbv: 28-дисс
2 декан: проф. med Wolfgang Schareck 1-й рецензент: 2-й рецензент: 3-й рецензент:
3 В подяку своїм батькам
4 ЗМІСТ. 1 1 ВСТУП Стенти в судинній хірургії Встановлені показання та інноваційне стентування сонної артерії Ідеальний стент Металевий стент Проблеми імплантації стента: Тромбоз і рестеноз Стратегії розв’язання Антитромботики Металевий стент з вивільненням лікарського засобу: Sirolimus Біорозкладані стенти Металевий стент та полімерний стент з вивільненням лікарських засобів МЕТОД МЕТОД RELEGEE Стенти Тест тварин та передопераційне лікування Анестезія, інтубація та вентиляція Моніторинг та прийом ліків Хірургічна процедура Модель анастомозу клубового шару Модель АКС Післяопераційне лікування та подальше спостереження Відбір проб та гістологія Статистична оцінка РЕЗУЛЬТАТИ Модель анастомозу клубової кістки Хірургічна процедура Наступні дії Гістологічна оцінка Модель АКС Хірургічна процедура Гістологічна оцінка
5 5 ОБГОВОРЕННЯ Модель свині Біологічні та фізичні властивості стента PLLA Тестування полімерних стентів in vivo РЕЗЮМЕ СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ СПИСОК СКОРОЧЕНЬ СПИСОК ФІГУР ПЕРЕЧЕНЬ ТАБЛИЦ НАУКОВА ЕФЕКТИВНІСТЬ ТЕКУЩИЙ ЗАВДАННЯ КУРИКУЛУ
12 Завдяки підтримуючій функції металевий стент може значною мірою сприяти запобіганню еластичної віддачі, але він не може пригнічувати неоінтимальну гіперплазію, що є ще одним вирішальним фактором у патогенезі рестенозу стента [47]. Рис.1: Рестеноз внутрішнього стента внаслідок неоінтимальної гіперплазії, ліворуч: гістологічний переріз, праворуч: макроскопічне зображення поперечного перерізу, [люб’язно надано MB Leon, Пресвітеріанська лікарня, Нью-Йорк, США.] Це показує реакцію стінки судини на найтонші механічні ураження Після зволоження ендотелію вплив субендотеліальних структур на кров призводить до запальної реакції судинної стінки. Завдяки вивільненню цитокінів та факторів росту, таких як фактор росту, одержуваний тромбоцитами (PDGF), епідермальний фактор росту (EGF), ß-трансформуючий фактор росту (TGF ß) та гепаринази, це призводить до активації та проліферації клітин гладкої мускулатури в оболонці ЗМІ. Після 9
14 контрольна група [52]. Місцеве гепаринове покриття стентів було клінічно встановлено з моменту публікації дослідження BENESTENT II [53]. Вони повинні гальмувати запальну реакцію судинної стінки та блокувати проліферацію клітин гладких м’язів. Таблиця 1: Фармакологічні засоби Протизапальні для зменшення рестенозу Immunodulatoren анти-міграції інгібіторів Proliferativa Reendothelisationsfaktoren дексаметазон M-преднізолон інтерферон гамма-1b, лефлуномида, сиролімус, такролімус, еверолімус zotarolimus мікофенольної мізорібін циклоспорину актиноміцин метотрексату ангіопептін, вінкристин, мітоміцін статини батімастат пролілгідроксілази, інгібітори галофугінон С-протеїнази, пробукол BCP671 VEGF Естрадіол NO донори EPC антитіла 11
22 Оцінка неоінтімальної гіперплазії Ступінь травми судинної стінки Запальний бал Ступінь запалення Зібрані дані аналізуються, порівнюються між собою та обговорюються у зв'язку з дослідженнями in vitro стента PLLA, які були записані в Інституті біомедичної інженерії Університету Ростока. 19-го
23 3 МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ 3.1. Стенти Металеві стенти (Phainon 6,0 x 26 мм, діаметр стійки 155 м) були виготовлені з нержавіючої сталі (316L) з аморфним покриттям з карбіду кремнію, а потім стерилізовані газом. Дизайн відповідає комерційній системі PEIRON (Biotronik GmbH & Co. KG, Берлін, Німеччина). Розширення балонним катетером відбувається протягом секунд до 8 бар без ризику розриву стента. Біоабсорбуючі стенти з полі-L-лактиду (PLLA) були розроблені та виготовлені в Інституті біомедичних технологій Університету Ростока в Варнемюнді [16]. Рис. 2: Розширюваний балоном стент PLLA до (A) та після (B) розширення балона Довжина балки = 10 мм. 20-го
24 Для виробництва використовується високомолекулярний полі-L-лактид (PLLA; Resomer L214, MG = г/моль, Boehringer, Ingelheim, Німеччина) без добавок. У процесі часткового автоматизованого нанесення покриттів, що управляється ПК, (покриття зануренням) корпуси з нержавіючої сталі (діаметр 2,8 мм, довжина 40 мм) опускаються в розчин PLLA/хлороформ за допомогою водолазного робота. Розчин автоматично заправляється за допомогою шприцової системи, щоб забезпечити рівномірне змочування занурювальних стрижнів. Процес занурення повторюють, поки не буде створена куртка з бажаною товщиною стінки 270 м. Це вимірюється без контакту з двовісною лазерною вимірювальною головкою (ODAC 32 XY, ZUMBACH Electronic, Орпунд, Швейцарія). Потім полімерні пробірки виймають із поршня скальпелем і сушать у вакуумі при температурі 40 ° С до досягнення вмісту хлороформу менше 2%. Остаточний процес промивання водою та метанолом використовується для видалення залишкового хлороформу. На другому етапі трубки розрізають за допомогою CO2-лазера (Wild Emco Lasertec, Hallein, Австрія). 3: зліва: водолазний робот, справа: CO2-лазер 21
25 Порізи контролюються ЧПУ. Для фіксації полімерні трубки розміщені на керамічній оправці, яка дозволяє лазеру рухатися вперед, назад і обертатися. Всі шляхи різання проходять двічі, щоб матеріал повністю прорізався. Кінцевим результатом є стенти PLLA розміром в мм і діаметром стійки 270 м, які завершуються шляхом остаточного розпилення на розчин PLLA Sirolimus у співвідношенні 70:30, покриття розпиленням препарату. Рис.4: Розпилювальне покриття - розпорошення розчину для покриття. Склад розчину є результатом попередніх випробувань, які показали, що сиролімус виділявся лише при концентрації щонайменше 20% [16]. Отримане покриття Pharmakon становить приблизно 1,5 г/мм 2. Поки стент не використовується, його зберігають у сухому місці при температурі 20 ° C, щоб продовжити термін зберігання. Оскільки стерилізація пов'язана зі зменшенням в'язкопружних властивостей [15, 16], цього не роблять. Однохвилинна дезінфекція стента етанолом відбувається безпосередньо перед імплантацією. 22-го
31 Процес анастомозу проводиться виключно одним і тим же хірургом (C.M.B.) за допомогою призматичної лупи зі збільшенням у 2,5 рази, щоб гарантувати якомога більшу стандартизацію хірургічної техніки. Рис.6: Імплантація біфуркаційного протеза аортобіііякал; інтраопераційний ситус. Імплантація стента рандомізована. Паралельно з препаратами для стенту (3.1.) На тварині затискають проксимальну (затискач Сатінського) та дистальну ніжку (затиск бульдога) загальної клубової артерії, а також приблизно см проксимальніше анастомозу. Обидві сторони посудини промивають через розріз і промивають кухонною сіллю гепарину. Після попереднього розтягування за допомогою Overholt, стент, обтиснутий на балонний катетер 6/40 мм (PHERON, Biotronik, Берлін, Німеччина), вводиться в середину області анастомозу і поступово розширюється під контролем зору. 28
32 Рис. 7: Імплантація стента під візуальним контролем. Стент розширюється шляхом надування балонного катетера до 8 бар. Як описано вище, металевий стент розширюється за лічені секунди, тоді як розширення стента PLLA займає 8 хвилин (1 бар/хв). Після репозиціонування катетера розріз, необхідний для доступу, закривається одними кнопковими швами (Prolene 6,0 BV), а загальна клубова артерія оголюється після видалення бульдога. Нарешті, перевіряються життєві параметри тварини. 29
33 Рис. 8: Надуття клубового анастомотичного стента, який макроскопічно видно крізь стінку судини. Після того, як стенти були успішно введені в судини, артеріальний катетер видаляють і аорту закривають проленом. Далі слід внутрішньовенне введення 1,5 г ампіциліну/сульбактаму (унациду) та промивання живота розчином гентаміцину NaCl, як для антибактеріальної профілактики. Після видалення надлобкового сечового катетера із закриттям Z-швом (Vicryl 3.0 SH) та репозиціонуванням кишкових петель, ретроперитонеум постійно повторно відкривають за допомогою 3.0. Вікриловий шов і очеревина закриті Мерсиленом. Підшкірний шов також виконують за допомогою запущеної 3.0. Вікриловий шов, шкіру зашивають розсмоктується ниткою після дезінфекції розчином йодиду. Крім того, підшкірно вводять 40 мг еноксапарину (Clexane) та 5 мл антибіотика широкого спектру дії окситетрацикліну (Terramycin, Pfitzer Animal Health, Exton, USA) у сідничні м’язи. 30-й
35 вводять один раз вранці та ввечері. Свиню перевозять назад до будинку для тварин. Допплерографічне дослідження: допплерографічне дослідження судин аорто-клубової кістки проводиться інтраопераційно (після протезів та після імплантації стента) та через два та шість тижнів після імплантації. Максимальний стегновий артеріальний кровотік (Fmax, кГц) визначається за допомогою безперервної хвильової техніки для оцінки властивостей потоку дистального анастомозу. Рис. 9: Доплерівське сонографічне дослідження кровотоку стегнової кістки Комп’ютерна томографія: Для того щоб визначити прохідність стента з часом, комп’ютерні томографічні дослідження за допомогою контрастної речовини (Tomoscan AV, Philips Germany; Aquileon TSX 101A, Toshiba, Germany) аорто-клубових судин проводяться після одного, двох, чотири та шість тижнів, використовуючи том 32
36 техніка візуалізації (VRT), що забезпечує одночасне відображення поверхонь і конструкцій, а також проекція максимальної інтенсивності (MIP), спеціальна техніка об'ємної візуалізації. Тварин використовували для досліджень, як у 3.3. описаний, заспокійливий. 10: КТ аорто-клубової області. Обидва стенти є безперервними. Велика стрілка: металевий стент, зламана стрілка: стент PLLA (не рентгеноконтрастний) Відбір проб та гістологія: Для того, щоб мати можливість оцінити судинні та периваскулярні зрізи в області стенту з гістоморфологічної та контурної точок зору, ділянки посудини, що несуть стент, а також зони переходу до протеза або до рідне судно експлантоване через 6 тижнів. 33
38 Рівень 1: Рівень 2: Рівень 3: Проксимальна частина стента та протеза анастомозу. Шов анастомозу Дистальна частина стента та посудини анастомозу. Зразки посудини вирізають товщиною шару 10 м, фарбують у розчині гематоксиліну/еозину (H.E.) та сушать. Гістопланіметрія: для того, щоб мати змогу морфометрично оцінити гістологічні зрізи, їх фотографують за допомогою цифрової камерної системи для мікроскопів (Axioskop 40, Axio Cam MRc5, Carl Zeiss, Гамбург, Німеччина) і передають на ПК. Усі розділи оцифровані для контурного аналізу та оцінені за допомогою програмного забезпечення Image J (версія 1.32j) з веб-сайту Національного інституту охорони здоров’я (. Для оцінки прохідності судин після інтервенції, діаметра залишкового просвіту (RL, мм) на рівнях 1, 2 та 3 за шість вимірювань, виходячи з межі неоінтами зі сторони просвіту, визначеної під кутом 60% і розрахованої з середнього арифметичного. Неоінтімальна гіперплазія визначається із середньої товщини інтими (MID, мм), яка знаходиться вище стійок на рівні 3 було виміряно, визначено 35
39 Гістоморфологія: Гістоморфологічну оцінку проводять двоє незалежних експертів, які засліплюють наявність сиролімусу в стентах PLLA. Оцінка травматизму Для напівкількісної оцінки ступеня пошкодження судинної стінки, спричиненого стентом, досліджують за допомогою світлового мікроскопа 4 послідовні розрізи, дистальні від анастомозу, і створюють індекс травми. Оцінюється кожна окрема стійка розділу та присвоюються числові оцінки (0 3): 0 ламіна elastica interna (LEI) ціла, середовище оболонки не стиснута, відсутність травм 1 LEI ціла або злегка розірвана, середовище стиснуте, не розірвано 2 LEI і розірвана середа оболонки тунки, перфорована адвентиція інтактна 3 lamina elastica externa (LEE), пошкоджена або перфорована адвентиція. Усі бали складаються і діляться на кількість оцінюваних стійок, щоб отримати оцінку травми для всього стента [48]: Оцінка травматизму (IS) = сума всіх оцінок, кількість оцінених стійок 36
40 запальних балів Ця класифікаційна оцінка використовується для фіксації ступеня та щільності запальної реакції тканини після імплантації стента. З цією метою кожну окрему стійку досліджують напівкількісно на предмет наявності запальних клітин у чотирьох послідовних розрізах, дистальних від анастомозу, і призначають числові оцінки (0 3): 0 відсутні запальні клітини 1 незначна субінтальна інфільтрація лімфоцитів та гістіоцитів 2 місцева помірна до щільна клітинна сукупність Лімфоцити та гістіоцити, що оточують всю розпірку. Запальний бал для всього стенту є результатом суми індивідуальних балів, поділеної на кількість оцінених розшарувань [93]. IF = сума всіх балів, кількість оцінок 3.9. Статистична оцінка: основні параметри операції та гістологічні дані представлені із середнім відхиленням +/- стандартним відхиленням. Відмінності порівнюють статистично, використовуючи непарний двосторонній Т-тест. Представлення вимірювань доплерівського ультразвуку з використанням середнього арифметичного. Дані 37
44 Подальша доплерівська сонографія: Після імплантації протеза безперервна хвильова допплерівська сонографія показує зменшення амплітуди систолічного кровотоку, який зворотним шляхом імплантації стента. Через шість тижнів у групі металевих та сиролімусових стентів PLLA не було гемодинамічного зменшення кровотоку стегна. На відміну від цього, спостерігається зменшення Fmax у групі стентів PLLA. Комп’ютерна томографія: у всіх стентованих груп відкритий просвіт на комп’ютерній томографії через 6 тижнів. Група PLLA без покриття демонструє порушення, що свідчать про стеноз. На відміну від цього, у групі Sirolimus PLLA спостерігається майже не порушений артеріальний потік. Оцінка просвіту після стентування металу є проблематичною, оскільки метал утворює артефакти в комп’ютерній томографії. 41
45 Рис.11: КТ аортоікальна. Обидві ніжки протеза та АІК відкриті (права металева, ліва PLLA). В області стента PLLA спостерігаються порушення, що призводять до помірного звуження просвіту Гістологічна оцінка Усі сегменти, що несуть стент, є суцільними, тромботична оклюзія відсутня. Гістологічна оцінка не показує доказів надмірної віддачі або колапсу стента. У всіх зразках можна знайти цілий круговий розріз. 42
46 Рис. 12: Гістологічний розріз, що демонструє відкриті металеві (*) та PLLA (**) стенти. Над стінками стента (S) видно неоінтімальну гіперплазію, яка більш виражена у PLLA. Фарбування ВІН, оригінальне збільшення 12,5 х. Рис. 13: Гістологічний розріз стента SIR-PLLA. Існує лише мінімальна неоінтимальна гіперплазія над стінками стента (S). є. Фарбування ВІН, оригінальне збільшення 12,5 х. 43
50 Гістологічна оцінка: усі стентовані сегменти мають відкритий просвіт, тромботичної оклюзії у серії досліджень не було. Гістологічна оцінка виявляє інтактний циркулярний розріз стента на всіх сегментах, відсутні ознаки надмірної віддачі або колапсу стента. Рис. 17: Гістологічний розріз в зоні АСС, метал зліва, PLLA справа. Видно утворення неоінтими над розпірками стента (S), що більш виражено у ФАПЧ. Фарбування ВІН, оригінальне збільшення 12,5 х. 47