Екстракти міцелію поліпори зменшують віруси у бджіл - наукові звіти -
Теми
Анотація
Хвилі високоінфекційних вірусів, що проносяться через глобальну популяцію медоносних бджіл, сприяли недавньому погіршенню стану здоров’я медоносних бджіл. Спостерігали, як бджоли харчуються грибним міцелієм, припускаючи, що вони можуть отримувати від грибів лікарську або харчову цінність. Відомо, що гриби виробляють широкий спектр хімічних речовин з антимікробною активністю, включаючи сполуки, активні проти бактерій, інших грибків або вірусів. Ми протестували екстракти міцелію з багатьох видів грибів-поліпор, відомих своїми противірусними властивостями. Екстракти грибів Tinder (Fomes) та Рейші (Ganoderma) знижують рівень вірусу деформованого крила медоносних бджіл (DWV) та вірусу озера Синай (LSV) залежно від наркотиків. У польових випробуваннях колонії, яким давали екстракт смолистого ганодерми, показали зниження DWV у 79 разів та LSV у 45 000 разів порівняно з контрольними колоніями. Ці результати вказують на те, що гриби та їх антимікробні сполуки можуть мати сприятливий вплив на здоров’я бджіл.
вступ
Повнорозмірне зображення
В даний час бджолярі можуть лише побічно контролювати рівень вірусу, використовуючи акарициди, щоб зменшити рівень зараження кліщами у медоносних бджіл. Загалом, ці зусилля дали лише обмежені результати, враховуючи те, як швидко кліщі Varroa розвинули стійкість до синтетичних акарицидів 20, 21. Іншим потенційним підходом було б зниження рівня вірусу безпосередньо у бджіл з використанням функціонального противірусного матеріалу, але в даний час такого продукту немає.
Є дані про те, що деякі гриби виробляють речовини з демонстративною противірусною активністю 22, 23, 24, 25. Наприклад, спиртові або хлороформні екстракти з культур міцелію та плодових тіл декількох грибів поліпор (Order Polyporales) мають активність проти вірусу віспи, ВІЛ-1 та грипу H1N1 24, 25, 26, 27. Спостерігали, як бджоли харчуються безпосередньо на вирощуванні міцелію на відкритих грядках 28 (рис. 1Б), що припускає, що вони можуть отримати харчову або медичну користь. Така поведінка може представляти нову грань соціального імунітету, оскільки все більша кількість доказів вказує на те, що медоносні бджоли займаються самолікуванням речовин рослинного походження 29, 30, 31. У цьому дослідженні ми оцінювали екстракти міцелію з декількох видів грибів поліпор, щоб визначити їх активність проти двох основних вірусів медоносних бджіл in vivo, як у лабораторії, так і в польових умовах. В обох випадках зменшення титрів DWV та LSV відбулося у бджіл, які отримували екстракти міцелію у сиропі сахарози.
Результати і обговорення
Лабораторні експерименти на бджолах, що перебувають у клітині, показали, що пероральна обробка екстрактів міцелію з видів деревних раковин значно знижує рівень DWV. Ефект від лікування екстрактами грибів, незалежно від видів, був дуже значним порівняно з бджолами, що харчувались лише цукровим сиропом (контроль рівня цукру DWV проти всіх обробок міцелієм: двосторонній t-тест, n = 58; t = 4,33, p = 0, 0001, ΔΔCt раз = 23,0). Екстракти Fomes fomentarius (amadou conk) та Ganoderma applanatum (художник) демонстрували значну противірусну активність в залежності від дози (рис. 1C). Найпотужніший екстракт, 1% (об./Об.) Екстракту F. fomentarius: цукровий сироп, зменшений DWV більш ніж у 800 разів у бджіл, що перебувають у клітині, порівняно з контролем цукрового сиропу (t тест двосторонній, n = 10, t = 1, 12, p = 0,005, ΔΔCt раз = 879).
Вірус озера Синай (LSV) зменшується за допомогою обробок на основі екстрактів грибів. ( AT ) Усі 36 бджолиних черевців у нашій вихідній популяції мали позитивні результати щодо DWV та LSV. LSV був більш виражений, ніж DWV, і вище, ніж референтний ген медоносної бджоли RpS5. ( ) Екстракти грибів знижували титри LSV у бджіл через 7 днів лікування. F. fomentarius значно зменшив LSV у дозі 1% (двосторонній t-тест, n = 8, t = 3,96, p = 0,009, ΔΔCt раз = 5,40). Найбільша різниця у зміні фактора спостерігалась у екстракту G. resinaceum, де лікування знижувало рівень LSV у бджіл у 499 разів порівняно з бджолами, які отримували лише сироп сахарози (двократні t тест-хвости, n = 8, t = 2,59, p = 0,084).
Повнорозмірне зображення
Екстракти грибів знижують рівень DWV та LSV у польових випробуваннях. ( AT ) Екстракти грибів змішували з розчином сахарози і розподіляли бджолам за допомогою годівниць для вуликів, які зазвичай використовуються в бджільництві. (B) Екстракти Фомеса та Ганодерми значно зменшили рівні DWV та LSV у польових випробуваннях із використанням 5-образних колоній із бджолами, розділеними від загальної популяції. У бджіл відбирали проби на рівень вірусу на початку лікування та через 12 днів. Колонії, що харчувались екстрактами G. resinaceum, продемонстрували 79-кратне зменшення DWV та 45 000-кратне зменшення LSV порівняно з контролем, що годували цукровим сиропом. Кількісна ПЛР Значення ΔCt нормуються до середнього рівня вихідного вірусу у всіх групах. Фото: WSS.
Повнорозмірне зображення
Це дослідження демонструє, що екстракти з декількох грибів поліпор знижують титри РНК вірусу у медоносних бджіл in vivo. Вважається, що віруси, включаючи групи DWV та LSV, відіграють важливу роль у загальносвітовій тенденції погіршення стану здоров’я медоносних бджіл 7, 9, 10, 11, 12, 13, проте в даний час для пасічників немає доступних затверджених противірусних матеріалів. Віруси, зазвичай асоційовані з медоносними бджолами, широко поширені серед диких запилювачів, що не належать до Апис 38, підкреслюючи важливість розробки засобів боротьби з вірусними інфекціями серед керованих популяцій. Випробувані тут екстракти міцелію є перорально активними і їх легко вживають бджоли, що передбачає потенційні можливості для бджолярів, які надають необхідні послуги з запилення. На додаток до потенційного прямого впливу на здоров'я бджіл, противірусна активність екстрактів грибів може служити інструментом дослідження для подальшого вивчення складних взаємодій між кліщами, вірусами та здоров'ям бджіл.
Методи
Приготування міцелінових екстрактів грибів
Наступні види/штами міцелію були зібрані та культивовані Полом Стаметсом:
Фоментаріус, Ітака, Нью-Йорк
Aplanatum Ganoderma, долина Даккабуш, штат Вашингтон
Trametes versicolor, Kamilche Point, Вашингтон
Культура Ganoderma resinaceum бере свій початок з анонімного джерела в Онтаріо, Канада.
Культури міцелію вирощували в стерильних чашках Петрі, що містять стерилізований солодовий дріжджовий агар (Fungi Perfecti, Shelton, WA). Після трьох-чотирьох тижнів колонізації в лабораторії чистого приміщення культури переносили асептично в 1000 мл шейкер Ебербаха, що містив 800 мл стерилізованої води. Міцелій був фрагментований у контейнері Ебербаха за допомогою змішувальної основи Waring. Потім міцеліальний бульйон розводили 1/10 у стерилізованій воді і переносили в стерильних умовах у поліпропіленові інкубаційні мішки, що містять приблизно 3 кг стерилізованого коричневого рису, який перед стерилізацією доводили до вологості близько 45%. Аликвоту 50-100 мл розведеної рідини переносили в кожен з стерилізованих 3-кілограмових мішків рису в стерильних умовах. Потім свіжі культури міцелію інкубували протягом 30 - 60 днів, залежно від виду, в чистому приміщенні, контрольованому HEPA. Потім кожен пакет мікоферментованого рису розділили на 20 поліпропіленових пакетів стерилізованих березових тирси (Betula papyrifera) (по 2 кг кожен) та інкубували протягом 30 - 60 днів залежно від виду.
Після того, як колонізація була визнана достатньою (див. Додатковий малюнок S1), субстрат, колонізований міцелієм, був заморожений для зупинки росту, а потім перенесений у контейнери з ПНД для екстракції. Субстрат міцелію змішували з 50% розчином етанол/вода (готували змішуванням рівних мас 95% органічного етилового спирту та джерельної води) до подвійної маси міцельованого субстрату, перемішували, а потім залишали для мацерації при кімнатній температурі від 3 до 5 годин. днів. Суміш фільтрували під тиском, а супернатант переливали у контейнери для зберігання при 4 ° C. Кінцевий продукт містить етанол, міцеліальні сполуки грибів та необов’язково невикористані компоненти субстрату для росту. Всі екстракти готували за стандартним виробничим процесом і використовували в наступних випробуваннях як сирі екстракти від ферментації на твердому субстраті без подальшого очищення або характеристики.
Клітинні та польові процедури з екстрактом грибів
Для вивчення клітин велика популяція була заповнена приблизно 10 кг робочих бджіл, які були скупчені в декількох колоніях і мешкали на одній пасіці в місті Пуллман, штат Вашингтон, США. Кожна експериментальна клітка (n = 5 на обробку) була заселена приблизно 300 робочими бджолами з популяційної клітки та підтримувалась у лабораторії з необмеженими джерелами води та 1: 1 сахарозою/водним сиропом без міри або екстрактами міцелію (1%). 0,1% або 0,01% об./Об. У сиропі 1: 1 сахароза/вода). Зразки 50 бджіл відбирали з кожної клітки/обробки повторюваного препарату на 7 день і заморожували до аналізу на титр вірусу. Клітки, де 50% або більше людей загинуло під час експерименту, не використовувались для подальших аналізів. Було проведено три випробування, і окремі бджоли відбирали проби з клітини популяції під час другого випробування для встановлення рівня окремих вірусів на малюнку 2А.
Для проведення польових досліджень в вересні 2016 р. Поблизу Москви, штат Айдахо, було створено 30 п’ятибазових «основних» колоній, кожна з яких несе матку і приблизно 8000 робочих бджіл. кілька колоній, що мешкають в експериментальних вуликах університету штату Вашингтон (Пулман, штат Вашингтон), і розміщені у великій скринінговій клітці. Для зберігання основних колоній приблизно 1 кг дорослих бджіл-робітників було вилучено з об’єднаної клітини популяції та додано до кожної експериментальної колонії. Колонії ядер утримувались надворі, що дозволяло вільний політ та нормальний пошук їжі протягом усього експерименту. Усі колонії відбирали проби перед лікуванням для визначення початкового рівня вірусу і знову через 12 днів після лікування. Десять повторних колоній годували екстрактами міцелію F. fomentarius або G. resinaceum у концентрації 0,01 (1% екстракт) у 3 л сиропу сахарози/води (екстракти) 1: 1 або годували сахарозою 1: 1 тільки сироп (контроль). ).
Віруси - обробка зразків, q-ПЛР та статистичний аналіз
Послідовності праймерів, що використовуються для qPCR, перелічені нижче. Послідовності праймерів DWV та RpS5 взяті від Englesdorp et al. 38, а послідовність для LSV - від Р. Корнмана в USDA-ARS (неопубліковані дані). Як праймери DWV, так і LSV розроблені для націлювання на зони генетичного збереження вірусів, що дозволяє виявити більшість генотипів.
A.mel- RpS5.F: AATTATTTGGTCGCTGGAATTG
A.mel- RpS5.R: TAACGTCCAGCAGAATGTGGTA
Послідовність
Оскільки ендофіти поширені у зрілих дерев, ми протестували неінокульовані березові тирсу на наявність ендогенних грибів, використовуючи секвенування наступного покоління. Ця тирса використовувалась для виготовлення екстрактів деревини берези і служила остаточним субстратом росту для грибів, що гниють деревину, використовуваних для виготовлення грибних екстрактів. Authentechnologies (Річмонд, Каліфорнія) використовували унікальні універсальні праймери для грибів для ампліфікації 11 460 послідовних зчитувань за допомогою ДНК-секвенсора наступного покоління.
Наявність даних
Набори даних, створені під час та/або проаналізовані під час поточного дослідження, доступні у відповідного автора за обґрунтованим запитом.
Дякую
Ми дякуємо пасічникам та іншим колегам, які зробили свій внесок у цю справу завдяки виїзній та лабораторній допомозі чи цікавим обговоренням: Філіпу Бейкеру, Стіву Сівіданесу, Рене Девісу, Джеймсу Гоуену, Вільяму Гайду, Еріку Олсону, Луї Шварцбергу, Бульмаро Солано, Лі та Джун Штайн . і Пильний Яо. Ми дякуємо Біллу Стаметсу за його коментарі до рукопису. NLN та JOH підтримав Фонд WWW під керівництвом Брайса, Емері та Адама Родса. WSS, LMC та BKH були частково підтримані проектом USDN-NIFA WNP00604.
Електронне додаткове обладнання
Додаткова інформація
коментарі
Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватися наших Умов обслуговування та рекомендацій спільноти. Якщо ви виявите щось образливе або не відповідає нашим умовам чи інструкціям, повідомте про це як невідповідне.